复方首乌软胶囊对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠p16基因表达的影响*

姚 毅，谭喜莹，王淑云，朱萱萱

江苏省中医院，南京 210029

复方首乌软胶囊是江苏省中医院传统中药制剂，主要由赤白首乌、地黄、牛膝、桑椹、女贞子、墨旱莲、桑叶、菟丝子、金樱子、黑芝麻、金银花等14味中药组成，具有补肝肾、强筋骨、乌须发的功效。临床实践表明，复方首乌软胶囊具有良好的抗衰老作用。药理实验证明，复方首乌软胶囊具有降低机体耗氧量,增加供氧量的作用，可明显延长小鼠游泳时间[1]。复方首乌软胶囊还可以增强机体内源性抗衰老物质SOD活性，从而抑制自由基对细胞的损害[2]。近年来的研究表明，基因是主导生物衰老过程的主要原因，衰老过程中多数原癌基因的表达或产物活性降低，抑癌基因则相反。p16基因是一种主要抑癌基因，p16的积累是衰老的诱因。抑制p16的表达，虽然不激活端粒酶，但是能减慢端粒的缩短，并增强DNA损伤修复能力，从而延缓了衰老的进程[3]。本实验采用D-半乳糖诱发的亚急性衰老模型，采用荧光定量PCR（Realtime-PCR）法检测小鼠脑中p16基因的表达，探讨复方首乌软胶囊对衰老基因p16表达的影响，进一步阐明复方首乌软胶囊抗衰老作用的生物学基础。

1 材 料

1.1 药品

复方首乌软胶囊（江苏省中医院制剂部）；活力苏口服液（主要成分:制何首乌、淫羊藿、黄精、枸杞、黄芪、丹参；成都地奥集团天府药业股份有限公司，批号:100202）；D-半乳糖（美国 Sigma公司，批号:G-0625）；Trizol试剂 （Invitrogen公司）；AMV反转录试剂盒（Promega公司）；Realtime-PCR引物由南京金思瑞生物公司合成；SYBR Green I核苷酸胶体染料（Invitrogen 公司）；Taq PCR Master Mix Kit（Qiagen公司）。

1.2 动物

ICR小鼠，由扬州大学提供，合格证号:苏SCXK（苏）2007-0001。给药前后小鼠分笼饲养，喂全价颗粒饲料，自由饮水。 室温（20±2）℃，湿度 55%～65%。

1.3 仪器

DNA电泳仪 （Pharmacia公司）；Eppendorf Biophotometer蛋白核酸测定仪（Eppendorf公司）；台式高速冷冻离心机（德国Hermle公司）；凝胶图像分析系统（Pharmacia公司）；iCycler iQ system型荧光定量 PCR 仪 （Bio-Rad Laboratories）；Opticon Monitor 2定量PCR仪 （美国MJ公司）；SDS-PAGE 电泳及电转印装置（上海天能公司）。

2 方 法

2.1 动物模型制备及分组

取ICR小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，随机分5组，每组 10 只。（1）空白对照组:20 mL·kg-1生理盐水（NS）；（2）模型对照组:20mL·kg-1生理盐水；（3）阳性药组（活力苏口服液组）:20mL·kg-1；（4）复方首乌软胶囊小剂量组:20g·kg-1；（5）复方首乌软胶囊大剂量组:40g·kg-1。 以上各组小鼠除空白对照组外其它4组每天皮下注射1.2%的D-半乳糖溶液0.01 mL·g-1，同时每天给予复方首乌软胶囊溶液灌胃治疗；阳性药组给予活力苏口服液对照；空白对照组和模型组给予生理盐水，给药容量均为20mL·kg-1。40天后处死小鼠，取大脑。

2.2 标本的采集与测定

2.2.1 标本的采集 取脑部海马组织50 mg，组织块直接放入研钵中，加入少量液氮，迅速研磨，待组织变软，再加少量液氮，再研磨，重复3次，按50 mg组织加入1 mL Trizol。将悬液移入1.5 mL EP管中，加入氯仿-Trizol（V∶V=1∶5）溶液，振荡混匀后室温放置 15 min。然后于 4 ℃、12000 r·min-1离心 15 min，取水相，加入0.5 mL异丙醇，混匀，室温放置10 min。 4 ℃、12000 r·min-1离心 10 min，弃上清液，加入用焦碳酸二乙酯 （DEPC）处理的75%乙醇1 mL洗涤沉淀。于 4℃，12000 r·min-1离心 5 min 后，尽可能将乙醇吸净，室温下干燥5～10 min，用20μL DEPC水溶解，-20℃低温保存。

2.2.2 使用Realtime-PCR检测p16 mRNA表达水平 根据文献，p16基因引物设计如下:上游引物UP:5′-TGTTCTCTCTGGCAGGTCAT-3′， 下游引物Down:5′-CTAGATCACTCAGTCCTCAC-3′；β-actin:5′-CCCGCGAGCACAGCTTCTTT-3′，5′-ATACAGCCCGGGGAGCATCG-3′，预期p16基因扩增产物为342bp，β-actin内参基因扩增产物为153bp。

使用Bio-Rad iCycler iQ system(Bio-Rad Laboratories)，按照以下条件进行荧光定量PCR。反应体系为:10×Buffer 2.5μL，三磷酸脱氧核糖核苷（dNTP，10 mmol·L-1）1μL，MgCl2（25 mmol·L-1）1.5μL， 上游引物 （10 pmol·L-1）1.5μL， 下游引物（10 pmol·L-1）1.5μL，Taq DNA 聚合酶（5 U·μL-1）0.2μL，SYBR Green I核酸染料（ 0.5×） 1μL，cDNA 模板2μL，加无核酶水至 25μL。反应条件为:94℃预变性4 min，94℃30 s，60℃30 s，72℃30 s，40 个循环。 反应结束后，分别计算CT值，每个样本重复6次，以平均数值来表示结果。

2.3 统计学分析

用2-△CT方法计算RNA的相对含量（相对于βactin的表达量）。数据分析采用SPSS 11.0统计软件进行，多组间比较采用单因素方差分析 （one-way ANOVA）。 结果以均值±标准误（x）表示，两两组间多重比较采用LSD方法进行检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 RNA的提取

提取的总RNA用紫外分光光度计鉴别其浓度和纯度，所有RNA样品的A260/A280的比值均在1.8～2.0之间，表明RNA纯度较好，可以用来做Realtime-PCR。

3.2 荧光定量PCR反应结果

在海马中，与正常组比较，衰老模型组p16基因mRNA表达明显上调（P＜0.01）；经药物治疗后复方首乌软胶囊大剂量组、复方首乌软胶囊小剂量组均能明显降低脑组织中p16 mRNA表达，与模型组比较P＜0.01。提示疏肝益肾方延缓衰老的作用与降低衰老基因p16的表达有关。结果见表1。

Real-time PCR产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳检测产物专一性，结果见图1。

表1 复方首乌软胶囊对小鼠脑海马组织p16 mRNA表达的影响（x，n=10）

表1 复方首乌软胶囊对小鼠脑海马组织p16 mRNA表达的影响（x，n=10）

注:与空白对照组；**P＜0.01

图1 引物专一性检测电泳图

4 讨 论

p16基因是一种重要的抑癌基因。近年来发现它在细胞衰老过程中起重要作用。研究表明，当成纤维细胞、T淋巴细胞、角质细胞、尿道上皮细胞等进入衰老时p16均过度表达，其持续表达导致了细胞衰老[4]。另一方面，Duan等[5-6]以p16正反义载体分别转染年轻的人成纤维细胞(ZBS)，发现p16过表达抑制了视网膜母细胞瘤基因产物（RB）的磷酸化，进而引起细胞早衰，而其反义载体转染可以延缓细胞衰老。因此p16的积累不是衰老的结果，而是衰老的诱因。因此，抑制p16的表达，可有效延缓衰老的进程[7]。

本实验通过观察复方首乌软胶囊对D-半乳糖致衰老小鼠p16 mRNA的表达，发现其能降低p16基因相对表达，这可能与其抗衰老作用机制相关，并且复方首乌软胶囊在较低剂量下就能有效地降低p16 mRNA的表达，从而起到抗衰老的作用。本文从分子水平探讨复方首乌软胶囊抗衰老的机理，为复方首乌软胶囊的进一步开发和利用提供了实验依据，为中药防治衰老提供一定的科学理论依据，为开发抗衰老中药、发扬祖国的传统医学提供新的思路。

[1]张忠华，白茹芹，沈 源.首乌软胶囊抗应激及衰老作用研究[J]. 南京中医药大学学报，2008，24（5）:338-40.

[2]张忠华，朱萱萱，王淑云，等.首乌软胶囊对D-半乳糖致亚急性衰老小鼠的实验研究[J].中华中医药学刊，2009，27（4）:765-6.

[3]胡作为，周燕萍，沈自尹.p16基因与细胞衰老关系的研究进展[J]. 国外医学(遗传学分册)，2004，27（4）:200-2.

[4]Palmerol,Meeonnell B,Parry D,et al.Accumulation of pl6 INK4αin mouse fibroblasts as a function of replicative senescence and not of retinoblastoma gene status[J].Oncogene,1997,15(5):495-503.

[5]Duan JM,Zhang ZY,Tong TJ.Senescence delay of human diploid fibroblast induced by anti-sense pl6 expression[J].J Biol Chem,2001,276(51):48325-31.

[6]Tsutsui T,Kumakura SL,Yamamoto A,et al.Accumulation of pl6 αand pRB inactivation with immortalization of human cells[J].Carcinogenesis,2002,23(12):2111-7.

[7]Wang W,Wu JF,Zhang ZY,et al.Characterization of regulatory elements on the promoter region of pl6 α that contribute to overexpression of pl6 in senescen fibroblasts[J].J Biol Chem,2001,276(52):48655-61.