T-钙黏蛋白基因在非小细胞肺癌中的表达及意义

王凤玲 尹延同 隋小芳 (佳木斯大学附属第一医院老年病科,黑龙江 佳木斯 154003)

肺癌是临床上常见的恶性肿瘤,已成为严重威胁人类生命健康的主要恶性肿瘤。肺癌的形成是一个多因素作用、多基因参与、多阶段逐渐形成的复杂演进过程,为了明确肺癌的形成及转移机制,阐述其病因和发病机制,己从基因水平进行了许多的研究,但是有关肺癌的发病机制尚不完全清楚,直接从RNA及蛋白质水平入手进行研究将有可能更加全面真实地揭示肺癌的发病机制。T-钙黏蛋白(CDH13)是一种新型的钙枯蛋白分子,近年来学者们发现在肿瘤中CDH13基因异常表达,CDH13在多种人类肿瘤中表达减少,因此,人们推断这种基因的功能或许是作为一种抑癌基因在起作用。但是也有学者发现该因子在肝癌及骨肉瘤等癌细胞中呈高表达。因此,其在肿瘤中的表达水平与肿瘤的关系引起人们的探讨。本课题采用RT-PCR法从基因水平检测CDH13在非小细胞肺癌中的表达,旨在探讨其在肺癌发生发展中表达差异的临床意义。

1 材料与方法

1.1 临床资料 实验组35例,组织标本取自佳木斯大学第一附属医院胸外科2009年10月至2010年7月非小细胞肺癌患者手术切除的肺组织。所有患者术前均未接受过放疗或化疗,病理诊断为肺癌,按组织学类型分为鳞癌11例、腺癌20例和腺鳞癌4例。肺癌患者年龄20～75岁,中位年龄为65.5岁。对照组1正常肺组织35例,取距离肿瘤组织边缘5 cm以上的远离癌的正常肺组织为对照。对照组2手术切除的良性病变肺组织15例,组织标本取自佳木斯大学第一附属医院胸外科同期5例肺结核球、10例支气管扩张患者手术切除的肺组织。

1.2 标本的采集及处理 实验组肺组织标本为肺叶切除离体后30 min内迅速切取的癌组织的标本,并取距离肿瘤组织边缘5 cm以上的远癌正常肺组织为对照,分装,液氮速冻,-80℃低温保存。

1.3 主要试剂 Trizol试剂、M-Mu LV一步法 RT-PCR试剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;利用Primer5.0引物设计软件自行设计两条引物,上游引物:5′TCACTGGAAAGGGAGTGGATC-3′, 下 游 引 物:5′-TCTTCATAAGCCCGAACTGG-3′,内参上游引物:5′-TCCTCCTGAGCGCAAGTAC-3′,内参下游引物:5′-GTCACCTTCACCGTTCCAG-3′,引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.4 方法

1.4.1 总RNA提取 取肺组织100 mg加入1 mlTRIzol研磨,彻底匀浆后分装至EP管,颠倒混匀,室温静置5 min,加氯仿1/5体积 (0.2 ml),颠倒混匀,室温静置 5 min后 4℃、12 000 r/min离心 15 min,转上层水相(约400 μ l)于另一1.5 ml EP管中,加等体积异丙醇(约400 μ l),混匀室温静置10 min后4℃、12 000 r/min离心10 min,弃上清加冰预冷的75%乙醇(用DEPC水配)1 ml,4℃、7 500 r/min离心5 min,弃上清,空气干燥5 ～10 min(不能完全干燥 )加入 10 μ l RNase-free ddH2O,吹打。紫外分光光度计测定其浓度和纯度后,-70℃保存。

1.4.2 RT-PCR扩增 严格依照RT-PCR试剂盒说明进行一步法RT-PCR扩增目的基因CDH13及内参 β-actin。按以下程序进行扩增:cDNA合成和预变性1个循环为38℃25 min,94℃2 min;PCR扩增40个循环为94℃15 s,56℃30 s,70℃1 min;终延伸1个循环72℃10 min。扩增结束后,取10 μ l扩增产物与1 μ l 6×loading Buffer混合后,在1%的琼脂糖凝胶上电泳,溴化乙啶染色,用天能GIS凝胶图像系统进行拍照分析。利用凝胶图像分析软件分析得出目的基因CDH13和内参 β-actin PCR产物条带吸收光强度值,计算目的基因和 β-actin吸收光强度值的相对比值,用以表示目的基因的相对表达强度(计算公式):目的基因CDH13的相对表达水平 =目的基因CDH13吸光强度值/β-actin光强度值。

1.5 统计学处理 实验数据以x ±s表示,采用方差齐性分析、两样本t检验,数据处理均用SPSS17.0软件完成。

2 结 果

如图1所示,对照组1和对照组2 CDH13在基因水平的表达无显著差异性(0.812 7±0.059 2 vs 0.816 3±0.073 2,t=0.213,P＞0.05);实验组(1.087 0±0.086 6)与对照组1CDH13表达,肺癌组织CDH13表达明显低于正常肺组织,存在明显差异性(t=-25.689,P＜0.05);实验组CDH13基因表达明显低于对照组2(t=-23.188,P＜0.05)。在肺腺癌(22/35)中CDH13表达为0.475 8±0.064 6,在肺鳞癌(13/35)中CDHA13表达为0.564 2±0.036 6,两者差异有统计学意义(P=0.012,P ＜0.05)。

图1 各组PCR扩增产物电泳图

3 讨 论

CDH13蛋白与其他已知的钙黏蛋白都不同,它是截短的钙黏蛋白(因此称truncated-cadherin),它的一个独特的特点就是缺少跨膜区和胞浆区,而是通过糖基磷脂酞肌醇锚定在细胞膜上。它的胞外区有5个约由110个氨基酸组成的重复结构域,在结构上与经典的钙黏蛋白非常相似,只是它的N-末端区ECI不包含经典钙黏蛋白所共有的His-Ala-Val序列。

CDH13另外一个特征就是在细胞表面同时表达它的两种存在形式,一种分子量为105 kD,另一种分子量为130 k D,105 k D的蛋白是成熟的T一钙黏蛋白,而130 kD的蛋白是未剪接的前体。CDH13蛋白的基因定位在人类染色体的16q24.2-3,其cDNA全长大约为3 842 bp,包括一个含714个氨基酸的开放读码框,其在维持正常细胞表型中起着重要的作用〔1〕,可以抑制细胞的增殖和迁移〔2〕,因此近年来被认为是一种新的抑癌基因,当这种抑癌基因下降时,致使机体的防御和稳定功能改变,对肿瘤细胞抑制作用减弱,而易发生恶性肿瘤〔3〕。

肺癌在分子遗传学方面的特征近年来正逐渐被人们所认识〔4〕,但其发病机制较为复杂,为多因素、多基因参与的过程〔5〕,而临床上所诊断的肺癌多已经为发病的中晚期,因此肺癌的防治应从分子水平入手〔6〕。在本文实验结果中显示出肺癌患者目的基因CDH13的表达明显低于正常肺组织,而正常肺组织和良性病变肺组织间对比CDH13的表达无明显差异,且肺癌患者CDH13的表达也明显低于良性病变肺组织,提示CDH13的低表达仅出现于恶性肿瘤如肺癌患者中;实验结果还显示出肺腺癌组织中CDH13的下降较肺鳞癌更为明显,这种差异机制可能是因为鳞癌的发生多源于各种致癌因素导致支气管上皮细胞鳞型化所致,而腺癌细胞在某些方面表现为Ⅱ型肺泡上皮细胞的特点〔7〕,恰恰 CDH13具有调节人类Ⅱ型肺泡上皮细胞表面蛋白的生物学特性,故CDH13异常下降更易引起肺腺癌的发生〔8〕。目前研究CDH13下降的原因可能与基因异常甲基化有关,而随着研究的不断深入,也有学者认为多数基因的甲基化是一个可逆的过程〔9〕,因此下一步的研究重点着重于CDH13基因甲基化的研究,找出导致CDH13下调的原因,从而控制CDH13基因的变化,为肺癌的治疗开辟一条新的领域。

1 Huang ZY,Wu Y,Hedrick N,et al.T-cadherin-mediated cell growth regulation involves G2 Phase arrest and requires P21(GIP/IAFI)expression 〔J〕.Mo1 Cell Biol,2003;23(2):566-78.

2 Vestal DJ,Ranseht B.Glycosyl,phosphatidylinositolanehored T-cadherin mediates caleium-dependent,homophilie cell adhesion 〔J〕.J Cell Biol,1992;119(2):451.

3 Kud-ashova,Bashtrikov P,Bochkov V,et al.Expression of adhesion molecule T-cadherin is increased during neointimaformation in experimental restenosis〔J〕.Histochem Cell Biol,2002;118(4):281-90.

4 张国桥.钙黏蛋白与肿瘤〔J〕.西南国防医药,2005;1(11):57-9.

5 Hommura F,Furuuchi K,Yamazaki K.Increased expression of β-catenin predicts better prognosis in nonsmall cell lung carcinomas〔J〕.Cancer,2002;94(3):752-8.

6 Lee SW.CDH13,a novel cadherin with growth inhibitory function and diminished expression in human breast cancer〔J〕.Nature Med,1996;2(7):776-82.

7 黄志勇,罗 钒,陈孝平,等.黏附分子T-cadherin表达对c6细胞恶性特性的影响〔J〕.中华实验外科杂志,2005;22(10):1205-6.

8 张志发,黄志勇,严 群,等.T-cadherin分子在人肝细胞癌的表达及共与肝癌恶性生物学特征的关系〔J〕.中华实验外科杂志,2008;25(7):829-30.

9 杨祖成,熊 霞 .T-钙黏蛋白与某些皮肤病的研究进展〔J〕.中国现代药物应用,2008;2(14):107-10.