淋巴结微转移检测对大肠癌病理分期的影响

于 游 张才全 (重庆医科大学附属第一医院胃肠外科,重庆 400016)

大肠癌是我国常见的恶性肿瘤,无淋巴结转移的大肠癌5年生存率一般在70% ～80%,而有转移者仅为 30%〔1〕。淋巴结转移是影响大肠癌预后的最主要因素之一,也是决定肿瘤分期和制定个体化疗方案的主要参考指标。因此,确定大肠癌有无转移对判断患者预后及指导治疗至关重要。本文70例大肠癌患者的1120枚淋巴结进行常规病理HE染色和CK20(CK20)及CEA免疫组织化(IHC)检测,并对两种方法淋巴结转移结果进行比较,目的在于探讨大肠癌患者淋巴结微转移对结直肠癌分期的影响,为大肠癌分期和制定个体化疗方案作出评价。

1 资料与方法

1.1 临床资料 2003年10月至2009年10月在我院住院行开腹切除手术的大肠癌患者70例,术前检查无远处转移,术前未进行过化放疗。其中男43例,女27例,年龄 32～78岁,平均年龄 55.1岁。部位:升结肠癌15例,横结肠癌 6例,降结肠癌12例,乙状结肠癌 12例,直肠上段癌15例,直肠下段10例。病理分型:高分化腺癌23例,中分化腺癌29例,低分化腺癌18例。TNM分期(1978年美国癌症协会(AJC)制定的结直肠癌国际 TNM标准):Ⅰ期4例,Ⅱ期29例,Ⅲ期37例。

1.2 试剂 CK20鼠抗人、CEA鼠抗人、即用型抗原修复液及SP试剂盒均购自福州迈新生物制品公司。

1.3 标本 70例结直肠癌标本,共检获大肠肠旁、肠壁、肠系膜淋巴结共1 120枚,平均每例(16.5±0.4)枚。每枚新鲜淋巴结标本,统一编号,用甲醛溶液固定,将各蜡块连续切片4张,1张行 HE染色,另3张行免疫组化SP法染色。

1.4 实验方法 石蜡包埋后切片厚度4 μ m,经二甲苯脱蜡、梯度酒精脱水后,柠檬酸缓冲液微波法修复抗原;3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶的活性;加入抗体,4℃过夜;DAB显色,显微镜下观察3～10 min,阳性染色为棕色或黄色;蒸馏水冲洗,苏木素复染,0.1%盐酸分化,PBS返蓝;切片经梯度酒精脱水干燥,中性树胶封固;光镜下观察结果。每次染色均以 PBS代替一抗作阴性对照,直肠癌组织作为阳性对照。结果判断以胞质黄染或棕色为阳性。CK20、CEA定位于细胞质内,阳性细胞呈棕黄色,边缘处显著。阴性者无着色,淋巴结中淋巴细胞不着色。淋巴结中发现CK20、CEA着色细胞,经高倍镜下确认有典型的癌细胞形态,诊断为存在微转移。

1.5 统计学处理 采用四格表 χ2检验,用 SPSS13.0软件完成统计学分析。

2 结 果

2.1 淋巴结转移及微转移检出率 用HE染色法淋巴结转移检出率26.9%(301/1 120),CK20免疫组化淋巴转移检测率为36.1%(404/1 120),CEA免疫组化转移检测率为34.7%(389/1 120),两者联合检测率为38.5%(431/1 120)。HE染色法与CK20及CEA免疫组化比较均有显著性差异(P＜0.05),HE染色法与两者联合检测率比较有显著性差异(P＜0.05),CK20与CEA免疫组化检测率比较无显著性差异(P＞0.05)。CK20检测出有微转移淋巴结103枚,占9.2%(103/1 120),CEA检测出有微转移淋巴结88枚,占7.9%(88/1 120)。CK20联合CEA检测出130枚淋巴结检出有微转移,占11.6%(130/1 120)。CK20、CEA及二者联合检测三组之间淋巴结微转移率比较显著性差异(P＞0.05)。微转移表现为单个散在或2～3个及数个聚集小团状的癌细胞位于淋巴窦内,以边缘窦为主,见图 1,图2。

图1 CK20阳性淋巴结(SP,×200)

图2 CEA阳性淋巴结(SP,×200)

2.2 淋巴结微转移对病理分期的影响 在70例患者检测出了有24例患者存在微转移,占34.3%(24/70)。13例 TNM分期提高,其中Ⅰ期Ⅲ期2例,Ⅱ期Ⅲ期11例。HE染色重新分期率为18.6%(13/70)。

2.3 淋巴结微转移与临床病理特征关系 微转移与癌肿浸润的深度有关,肿瘤浸润愈深,微转移愈易发生(P＜0.05)。微转移还与组织类型有密切关系,分化程度低者,微转移阳性率高(P＜0.05)。但微转移与性别、年龄、肿瘤的部位、大小无关(P ＞0.05),见表1。

表1 结直肠癌淋巴结微转移与临床病理特征关系〔n(%)〕

3 讨 论

结直肠癌患者,其局部原发灶采用手术为主的治疗方法基本可以控制。但根治术后,其复发和转移率高达30%～50%左右,特别是无“淋巴结转移”的Ⅰ期和Ⅱ期患者,5年内死于局部复发或转移的近30%〔2〕。分析其原因可能是因为淋巴结、血道、骨髓中存在的微小转移灶,用传统的病理检查方法很难检出,而导致临床无法及时和正确治疗〔3〕。传统上对淋巴结的病理学检查是通过对其具有代表性的一个切面经HE染色作普通光镜检查,这种常规方法不能查累及淋巴结的大部分组织,故有可能忽略淋巴结微转移的存在。由于这些微转移有发展成致命的显性转移的可能,因此微转移的检测日益为人们所重视。近年来,随着组织化学和分子生物学技术的发展,利用免疫组化法可以发现常规HE染色所不能发现的单个癌细胞。Palma等〔4〕运用该方法分析了38例 Dukes B期结直肠癌患者枚淋巴结,检查发现7枚淋巴结存在微转移灶。吴泽宇等〔5〕应用PCR技术对30例胃癌患者共850枚淋巴结检测微转移,结果有77枚淋巴结检出有微转移,7例患者的肿瘤TNM分期提高,HE染色重新分期率为23.3%(7/30)。但关于淋巴结微转移检测对结直肠癌临床病理分期的影响尚未见文献报道。本研究中,在70例结直癌病人1 120枚淋巴结中有24例患者共130枚淋巴结检测出了微转移,13例患者TNM分期提高,HE染色重新分期达18.6%(13/70)。故免疫组化的检测可以显著提高淋巴结转移的检出率,有助于更准确地进行结直肠癌的临床病理分期。为大肠癌合理制定手术方案、指导手术清扫淋巴结及后续治疗提供科学保证,减少结直肠癌术后转移及复发、提高结直肠癌以手术为主的综合治疗的疗效。

由于肿瘤细胞具有异质性,肿瘤相关基因的表达水平会有很大的差异,单用一种标志物只能检测出高表达该基因的癌细胞,而对于低水平表达该基因的癌细胞就可能漏检,所以多标志物联合检测微转移已成为目前新的研究热点〔6,7〕,许多学者也在不断在探索联合检测两种或两种以上肿瘤标志物的方法,目前研究比较多的是 CK、CEA、nm23-H(1)、MMP(9)及 TIMP(2)〔8〕。CK系列被认为是检测循环癌细胞的敏感标记物。CEA是公认的检测循环癌细胞的敏感标记物。笔者认为,多标志物联合检测不仅有助于准确肿瘤分期,可有效避免单一指标造成的遗漏,有助于微转移的诊断。但在本实验中CK20、CEA联合检测并未显著提高微转移检测率,并不能否定标志物联合检测微转移的发展趋势,可能与本实验选择检测肿瘤标志物组合不当有关,应摸索更合理的组合,进一步研究。

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4 Palma RT,Waisberg J,Bromberg SH,et al.Micrometastasis in regional lymph nodes of extirpated colorectal carcinoma:immunohistochemical study using anti-cytokeratin antibodies AE1/AE3 〔J〕.Colorectal Dis,2003;5(2):164-8.

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