丙酮酸高产菌诱变选育及发酵工艺优化的初步研究

胡浩然，石 勇，陈 雄

(湖北工业大学生物工程学院 发酵工程省部共建教育部重点实验室，湖北 武汉 430068)

丙酮酸(Pyruvic acid)，又称2-氧代丙酸、乙酰基甲酸或α-酮基丙酸，为无色至淡黄色液体，呈醋酸香气和愉快酸味，是最重要的α-氧代羧酸之一。丙酮酸不仅在生物能量代谢中具有十分重要的作用，而且是多种有机化合物的前体，因此，在化工、制药等工业领域及科学研究中都有广泛的用途[1]。近年来，对丙酮酸及其衍生系列产品的开发利用正日益深入，商业需求持续增长[2]。

早在20世纪90年代，丙酮酸就实现了工业化生产，采用的工艺为酒石酸脱水脱羧法，但丙酮酸产率较低。日本学者经过近40年的研究选育出了丙酮酸高产菌株，并于1989年率先实现了流加培养技术工业化发酵生产丙酮酸，产酸量达67.8 g·L-1。作者在此以光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)为出发菌，通过紫外、化学诱变的方法选育出营养缺陷型丙酮酸高产菌，并对其产酸性能进行了初步的研究。

1 实验

1.1 出发菌株

光滑球拟酵母(Torulopsisglabrata)HB20，自行保藏。

1.2 培养基

(1)斜面培养基：无水葡萄糖 20 g，酵母抽提物 20 g，蛋白胨 20 g，蒸馏水 1000 mL，琼脂 20 g，pH值5.5。

(2)种子培养基：无水葡萄糖 100 g，蛋白胨 30 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸馏水 1000 mL，pH值5.5。

(3)发酵培养基：无水葡萄糖 100 g，(NH4)2SO46 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，盐酸硫胺素 0.03 mg，盐酸吡哆醇 1.0 mg，生物素 0.03 mg，烟酸 8.00 mg，CaCO340 g，蒸馏水1000 mL，pH值5.5[3]。

(4)溴甲酚绿固体完全培养基：无水葡萄糖 40 g，(NH4)2SO43 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，盐酸硫胺素 0.03 mg，盐酸吡哆醇 1.0 mg，生物素 0.03 mg，烟酸 8.00 mg，1% 溴甲酚绿乙醇溶液 20 mL，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH值5.5。

(5)基本培养基：葡萄糖10 g，(NH4)2SO40.5 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，琼脂20 g，蒸馏水1000 mL，pH值5.5。

1.3 培养方法

从新鲜斜面上接一环菌于种子培养基，在30℃、220 r·min-1下培养24 h后，以10%接种量接入发酵培养基。摇瓶发酵装液量为100 mL/500 mL锥形瓶，转速为220 r·min-1，发酵时间为60 h。

1.4 诱变方法及突变株的筛选

取5 mL培养液于4800 r·min-1离心10 min，收集菌体，用5 mL pH值7.0的磷酸钠缓冲溶液洗2次，然后将菌体重新悬浮于适量的缓冲溶液中，制成细胞浓度为1×107个·mL-1的菌悬液。

UV诱变：开启25 W紫外灯，使光波稳定30 min，备用。吸取8 mL待测菌悬液，移入直径9 cm培养皿中，使液面高度在2 mm左右。距离紫外灯管25 cm处垂直照射一定时间，照射时打开培养皿，并采用电磁搅拌器缓慢振荡。关闭紫外灯，开启红光灯，取0.2 mL UV诱变的菌液涂布于溴甲酚绿培养基平板上。将涂布好的平板用黑纸包好，放入30℃恒温培养箱，培养2～3 d。活菌计数并与对照比较，计算致死率。在最佳诱变剂量下诱变处理原菌，稀释梯度涂布平板，根据变色圈大小初筛出一批菌株，将这些菌株与原菌同时进行摇瓶发酵实验，复筛出产酸量较高的菌株。

DES诱变：吸取700 μL UV诱变菌液加入到装有20 mL缓冲溶液的锥形瓶中，稀释30倍，加入0.2 mL DES，使DES在菌悬液中的体积分数约为1%。38℃振荡处理一定时间，加250 μL 25%硫代硫酸钠到试管中，终止反应，并涂平板。与对照比较，计算致死率。在最佳诱变剂量下诱变处理UV诱变复筛出的菌株，同样根据变色圈大小初筛、摇瓶发酵实验复筛出产酸量较高的菌株。

1.5 分析方法

生物量测定：发酵液稀释至相应倍数，于660 nm可见光下测定其吸光值。

葡萄糖含量测定：采用3，5-二硝基水杨酸法(DNS)[4]。

丙酮酸含量测定：采用2，4-二硝基苯肼比色法[5]。

维生素缺陷型的鉴定：将待鉴定的菌株接到基本培养基平板上，将浸有维生素营养物质混合液的滤纸片贴在平板上，培养2～3 d，观察其生长情况。

2 结果与讨论

2.1 菌株的诱变选育

2.1.1 致死率和正突变率的比较

采用不同的UV和DES诱变剂量对菌株进行诱变处理，所得致死率和正突变率见表1。

表1 UV和DES诱变处理的致死率和正突变率/%

由表1可知，UV诱变40 s和DES诱变16 min的致死率都介于60%～80%之间，且正突变率都较高。因此，选取UV诱变40 s、DES诱变16 min选育菌种。

2.1.2 UV诱变的初筛与复筛

经最佳剂量的UV诱变后，挑取变色圈与菌落直径比较大的单菌落初筛出一批菌株。将这些菌株与原菌同时进行摇瓶发酵实验，比较各菌株的产酸量，复筛出8株产量较高的菌株，其产酸量见表2。

表2 UV突变株与原菌产酸量比较/g·L-1

2.1.3 DES诱变的初筛与复筛

将经UV诱变筛选出的8株突变株经DES诱变处理后，从溴甲酚绿固体完全培养基上初选出5株菌，分别命名为HB301、HB302、HB303、HB304、HB305，把它们与原菌接到发酵培养基中进行摇瓶培养，其产酸量见表3。

表3 UV-DES突变株与原菌产酸量比较/g·L-1

由表3可知，HB304比原菌HB20产酸量增加了31.2%。

将获得的5株突变株分别转接斜面5代，1、3、5代每代转接3个摇瓶进行发酵实验，考察产酸能力的遗传稳定性，结果见表4。

表4 UV-DES突变株的遗传稳定性/g·L-1

由表4可知，HB304在传代过程中产酸能力稳定，而HB305株菌在传代3次后，产酸能力有所下降。综合考虑菌株的产酸能力和遗传稳定性，确定突变株HB304为进一步研究用菌株。

2.2 产丙酮酸突变株HB304的维生素需求鉴定及分析

对产丙酮酸突变株HB304的维生素需求进行鉴定，结果见表5。

表5 各种维生素对HB304生长的影响

实验发现，在不含盐酸硫胺素、烟酸、盐酸吡哆醇、生物素而含有其它维生素的滤纸片周围无菌落出现，在含有盐酸硫胺素、烟酸、盐酸吡哆醇、生物素而缺少其它维生素的滤纸片周围出现菌落。说明产丙酮酸突变株HB304是盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸和生物素4种维生素的缺陷型。研究表明，球拟酵母属菌株，特别是维生素营养缺陷型的菌株更能大量地积累丙酮酸。由于丙酮酸脱氢酶系的辅因子为烟酸和盐酸硫胺素、丙酮酸羧化酶的辅因子为生物素、丙酮酸脱羧酶的辅因子是盐酸硫胺素，营养缺陷型菌株自身无法合成这些维生素，因此，当这些维生素的浓度处于亚适量水平时，丙酮酸就得以积累。

2.3 培养基的优化

2.3.1 葡萄糖初始浓度的确定

以葡萄糖为碳源、(NH4)2SO4为氮源，固定(NH4)2SO4浓度为6.0 g·L-1，考察葡萄糖初始浓度对发酵的影响，结果见表6。

表6 葡萄糖初始浓度对发酵的影响

由表6可知，葡萄糖初始浓度在60～100 g·L-1时，菌体浓度、丙酮酸产量及残糖浓度随其浓度的增加而上升；葡萄糖初始浓度在100～140 g·L-1时，菌体浓度、丙酮酸产量随其浓度的增加而降低，残糖浓度依然上升。这表明过高的葡萄糖初始浓度对菌体生长产生抑制，导致残糖浓度增加，浪费了原料，提高了生产成本；而葡萄糖初始浓度过低又会使发酵过早结束，微生物利用完葡萄糖后又转而利用丙酮酸，导致丙酮酸产量降低。

2.3.2 (NH4)2SO4浓度的确定

固定葡萄糖初始浓度为100 g·L-1，考察(NH4)2SO4浓度对发酵的影响，结果见表7。

表7 (NH4)2SO4浓度对发酵的影响

因此，优化的葡萄糖初始浓度为100 g·L-1、(NH4)2SO4浓度为7.0 g·L-1，此时菌体生长较好，丙酮酸产量较高，达19.19 g·L-1，较原菌提高了41.9%。

2.4 讨论

糖酵解途径的最终产物丙酮酸处于代谢途径中的关键代谢支点，在细胞中很容易代谢为其它产物，难以积累。要使其在细胞中积累并分泌到胞外，就只有切断或弱化丙酮酸的进一步代谢。提高丙酮酸产量的方法主要有：(1)在保证细胞正常代谢的前提下，尽可能减少丙酮酸的降解或转化；(2)加快从葡萄糖到丙酮酸的代谢速度，以确保获得丙酮酸的高生产强度[6]。实验中筛选出的HB304是盐酸硫胺素、盐酸吡哆醇、烟酸和生物素的营养缺陷型突变株，而这4种维生素直接影响了丙酮酸在细胞内的代谢。

3 结论

通过诱变育种筛选出的产丙酮酸突变株HB304在培养基未经优化的条件下，摇瓶发酵产酸量较原菌提高了31.2%，通过初步优化培养基初始碳、氮源，摇瓶发酵产酸量较原菌提高了41.9%。作为多种维生素营养缺陷型的HB304具备大量积累丙酮酸的潜力，通过进一步优化培养基成分，提高丙酮酸的产量，最终可望用于工业化生产。

[1] 陈坚，李寅.发酵过程优化原理与实践[M].北京：化学工业出版社，2001：129-130.

[2] 李寅，陈坚，陈燕，等.丙酮酸高产菌株的选育及中试研究[J].工业微生物，2001，31(2)：10-13.

[3] Hua Qiang，Araki Minako，Koide Yohko，et al. Effects of glucose，vitamins，and DO concentrations on pyruvate fermentation usingTorulopsisglabrataIFO 0005 with metabolic flux analysis[J]. Biotechnol Prog，2001，17(1)：62-68.

[4] 陈毓荃.生物化学实验方法和技术[M].北京：科学出版社，2002：97-100.

[5] 张宗祥.采用微生物发酵制取丙酮酸的研究[D].南京：南京理工大学，2004.

[6] 李寅，陈坚，伦世仪，等.维生素在丙酮酸过量合成中的重要作用[J].微生物学报，2000，40(5)：528-534.