单一试剂连续监测法测定α-L-岩藻糖苷酶

王祖莲

（石屏县人民医院，云南 石屏 652200）

AFU是1种溶酶体酸性水解酶，分类名为α-L-岩藻糖苷水解酶 （EC 3.2.1.51）[1]。自从1980年法国学者Deugnier等报道原发性肝癌（PHC）的病人血清AFU活性升高，并经国内外研究证实，已确认AFU是PHC高灵敏的特异性标记物。建立1种方便适用的AFU检测方法尤为重要。

用于AFU测定的方法主要有2类：（1） 以4-甲基伞型酮-α-L-岩藻吡喃糖苷为底物的荧光法[2]。（2） 以对硝基苯-α-L-岩藻糖苷为底物的比色法[3]。前者检测灵敏度高，适用于微量样品及低活性样品的检测，但此法步骤繁琐，又需要荧光光度计，常规应用受到限制。后者是目前临床实验室主要采用的方法，在酸性时AFU水解对硝基苯-α-L-岩藻糖苷产生对硝基酚，水解反应完成后，需用碱性缓冲液终止反应并显色，此测定原理决定了测定为2点终点法，且需设样品空白以去除本底的干扰，操作较繁琐。

随着新合成底物2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷（CNP-AFU）的出现，以此为底物的速率法也叫连续检测法，近年来普遍应用于临床实验。CNP-AFU速率法采用单一试剂，有较高的灵敏度和精密度，较强的抗干扰性，线性反应时间长，试剂稳定性好。本实验采用了此种方法原理，研究了一些检测条件，建立了单一试剂连续监测法测定α-L-岩藻糖苷酶。

材料和方法 岛津UV-2401PC分光光度计，Cole Parmer pH计，CB171半自动生化仪，HITACHI 7060全自动生化仪。

试剂：基质缓冲液：0.1MMES-NaOH（以下简称MES缓冲液）：无水2-N-吗啉乙磺酸（MES， C6H13NO4S， MW=195.2） 19.52g， NaCl 8.5g，NaN30.3g，蒸馏水溶解，用0.1MNaOH溶液调pH为4.8，置于冰箱保存。CNP标准溶液：5.0mmol/LCNP标准溶液，准确称取0.0434g 2-氯-4-硝基苯酚（CNP，C6H4ClNO3，MW=173.56，上海二医大化学教研室提供），用基质缓冲液溶解，配成50ml 5.0mmol/L标准液，置于棕色瓶放冰箱保存。基质溶液 （1.2g/L）：准确称取 CNP-AFU（C12H14ClNO7，MW=319.75，上海二医大化学教研室提供）0.3g，用MES基质缓冲液溶解，并加至250毫升容量瓶刻度，置于棕色瓶瓶放冰箱保存。

样本 健康人血清（正常组）；PHC患者血清（病理组）。干扰物质 抗坏血酸、胆红素、血红蛋白。

方法原理 用2-氯-4-硝基苯-α-L-岩藻糖苷在AFU催化下，分解成α-L-岩藻糖苷和2-氯-4-硝基苯酚，37℃时在波长405nm处可使吸光度值增加，连续监测吸光度值的变化，可计算出样品中AFU的活性。测试参数：温度为37℃；波长λ=405nm，试剂样品比10∶1，延迟时间60s，测定时间120s。使用如公式计算：

注：ΔA/min：每分钟吸光度变化值；106：将mol换算成μmol；SV：样本体积；TV：反应总体积；ε：产物CNP的摩尔吸光系数；p：比色杯光径。

结 果 1.反应体系缓冲液选择 分别以pH5.0，0.1mol/L的柠檬酸、醋酸、EMS缓冲液配制相同浓度底物基质液，测定同一人血清样品。在酶促反应经时曲线和反应线性稳定性方面，MES缓冲液为最佳（见图1），所以实验选用MES缓冲体系。

2.CNP摩尔吸光系数：对溶于pH4.6～5.4、0.1mol/L的MES缓冲液中的0.05mmol/L CNP，测定其在波长405nm的吸光度，得到CNP在不同pH处的摩尔吸光系数，见图2。在此pH范围内，CNP在405nm的吸光度是随着pH增大而增大。

3.最适pH的确定 选择5种不同pH值（4.6～5.4） 的MES缓冲液，分别配制浓度为5 mmol/L的5种基质液。对同一样本，分别用这5种基质液测得不同pH下的ΔA/min，再以上面的摩尔吸光系数算出酶活性，见表1。当pH=4.8时，测定的酶活性最大，故选择体系的最适pH是4.8。

表1 同一样本在不同pH下酶促反应及酶活性

4.底物浓度的确定 以pH4.8的EMS缓冲液配制系列底物浓度 （0.05、0.10、0.20、0.30、0.04、0.5mmol/L） 基质液，在其他条件不变下，用速率法测定同样本AFU酶活性。以Lineweaver-Burk双倒数法作图求出Km值为0.148mmol/L（见图 2，是斜率除以截距，即0.0035÷0.0237≈0.148）。根据米曼氏方程，确立本实验的底物浓度为3.75mmol/L，大约是25倍Km值。

5.酶促反应经时曲线观察及延迟时间和测定时间的确定 以pH4.8、0.1mol/L的EMS缓冲溶液，配成3.75mmol/L的基质溶液，在分光光度计上，取高低2个不同的样本（20，60U/L） 连续扫描800s，观察酶促反应的吸光度变化，从图4可看出延迟时间60s后，整个曲线均匀上升，酶促反应线性时间可达到10min。因此，根据大量的实验结果表明，此速率法的延迟时间确定为60s，测定时间确定为120s。

6.基质液稳定性 将底物浓度为3.75mmol/L的基质溶液，分别置于4℃和37℃避光存放。测定0、1、3、5、7和15d时的基质液空白吸光度，结果表明，置于37℃时，基质液只能保存3d；而存放4℃的基质液在15d内其空白吸光度的变化不大，仍可使用。

7.批内重现性 分别对低、中、高值血清重复7次测定，统计均值，标准查和变异系数，来观察CNPF速率法的批内重现性，结果表明此法批内重现性良好（平均cv2.1%），符合临床诊断试剂的要求（表2）。

表2 CNPF速率法的内变变异（n＝7）

8.抗干扰性能 考虑到人体样本中潜在的干扰物质，对3种可能存在的干扰物质进行了抗干扰性试验，结果发现140mg/L胆红素、350mg/L血红蛋白和6g/L抗坏血酸对AFU酶活性的测定无显著影响。说明该法有较强的抗干扰能力。

9.临床正常和病理组的检测 上述建立的AFU速率法在HITACHI7060自动分析仪上测定了120例健康者和35例经临床确诊为PHC患者的血清AFU。经t检验p＜0.001，2组有显著性差异。（见表 3）

表3 正常和病理组的检测

讨 论 1.速率法相比其他检测法具有明显的优点：（1） 新型底物CNP-AFU的出现，是近年来CNPF速率法迅速得以建立，并逐渐普及于临床应用。因为CNPF法所采用的显色原是CNP，其解离常数kPa为5.5，接近于AFU的最适pH值。该pH环境下CNP在405nm处能较好的呈色，无需做样品空白，克服了PNPF方法的缺陷，便于自动分析仪的应用。

（2） 实验进行3种缓冲液体系的筛选，众多实验结果表明：醋酸缓冲液对有些样品产生副作用，发现样品加入醋酸缓冲基质液后变混浊，反应曲线下滑，无法检测样品的活性。柠檬酸缓冲液的体系下，酶促反应的线性时间稍短（约为3min），另外柠檬酸缓冲基质液的稳定性不好。MES为Goods氏系列缓冲剂之一，也是主要的生物缓冲剂。本法选用MES-NaOH缓冲体系，其优点在于：①MES缓冲液对样品无副作用；②在MES缓冲体系下，产物CNP的摩尔吸光系数较高，反之计算因数较低，提高了测试的精密度。③酶促反应的线性时间长（大于10min），提高了速率法在临床应用的可信度。④本实验测得在MES缓冲体系下，AFU酶的Km值为0.148mmol/L，较李兴民等人[4]的研究结果低，使得底物浓度降低，底物的水解速度减少，增加了试剂的稳定性。

（3）实验进行了抗干扰性的研究，结果发现，6g/L抗坏血酸、140mg/L胆红素、350mg/L血红蛋白对AFU酶活性的测定不产生干扰，总体的抗干扰能力与李兴民等人[4]报道建立的方法相当。

2.临床检测方面：（1） 研究发现，溶血的血清样本明显提高AFU测定值，且随着溶血程度的加深，AFU增高幅度变大。可能是红细胞释放的某些成分的干扰，因此在临床应用中注意。在样本的收集和处理时切勿使样本溶血，收到样本后应尽快分离血清并低温保存，以免影响测定结果。至于溶血使AFU升高的确切机制尚待进一步探索。

（2）由于AFU的各同功酶的活性不一，导致人群中AFU含量的变化幅度较大。实验表明，大约4%正常人血清AFU活性低于1U/L，但也有个别样本超出正常范围。本文的正常参考值范围为(21.6±3.94)U/L，比文献值[4]略低，且范围略小。有报道[5]，正常人群中血清AFU活性较低者的白细胞AFU活性正常；还特别指出，在临床检测中如遇到AFU活性极低者，不要轻易排除（如对肝癌等诊断） 或肯定（如对岩藻糖苷贮积病的诊断）某疾病的可能性，最好同时检测被检测对象白细胞岩藻糖苷酶的活性，再作定论。

（3）本文建立的AFU速率检测法经过在临床上的初步应用，PHC病人血清的AFU活性明显高于健康者，而且研究结果显示AFU对PHC阳性率高达90%。倘若AFU和AFP联合检测，预计对PHC的检出率可达95%以上。

［1］王坤，施前.实用诊断酶学[M].第2版.上海：上海医科出版社，2000：12.

［2］WOODS.Asensitive flourimetric assayfor α-L-fucosidase[J].ClinchimActa,1975,58:251-256.

［3］TROOST J,VAN DER HEIJDEN MC,STAAL GE.Characterization of alpha-L-fucosidase from two different families with fucosidosis[J].ClinchimActa,1976,73:329-346.

［4］李兴民，司伊康，杨树德.新色原底物的合成及α-L-岩藻糖苷酶速率检测法[J].中华医学检验杂志，1999，22：157-160.

［5］张进平，钟金慧.溶血对α-L-岩藻糖苷酶测定的影响[J].中西医结合杂志，2000，9：1030-1031.