海参岩藻聚糖硫酸酯对小鼠急性酒精中毒防治作用的研究

滕来宾，王静凤，杨延存，李 冰，张 珣，薛长湖

(中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛 266003)

急性酒精中毒又称醉酒，指短时间内饮入过量的酒精或酒精饮料后所引起的中枢神经系统兴奋及随后的抑制状态。在美国，过量饮酒引起的肝脏疾病已成为男性的第4大主要死亡原因［1］。因此，寻找一种有效的解酒护肝食品或药品是很有必要的。海参多糖是海参体壁中重要的活性成分，主要可分为海参岩藻聚糖硫酸酯(fucoidan isolated from sea cucumber，SC-FUC)和海参硫酸软骨素两种组分。其中，SC-FUC是一类主要由岩藻糖组成的硫酸多糖，属于岩藻聚糖硫酸酯类化合物，主要存在于褐藻门植物和棘皮动物体内。目前，有关褐藻岩藻聚糖硫酸酯的生物活性有较多报道，例如，抗氧化、抗肿瘤、降脂、降血压、保护肝脏、增强免疫力等［2-6］。与褐藻岩藻聚糖硫酸酯相比，SC-FUC化学结构差异较大［7-8］，其活性仅在抗凝血、增强免疫力等方面有少量报道［9-10］。海地瓜(Acaudina molpadioides)为芋海参科棘皮动物，俗称海茄子，盛产于亚热带沙质海区，在我国的海南、广东、福建、浙江沿海等地资源量丰富，市场价格低廉［11］。本实验室前期研究表明，海地瓜体壁富含SC-FUC(约占干重4%)，但目前对海地瓜的开发利用仍处初级加工水平。本实验利用从海地瓜中制备的SC-FUC研究了其对过量饮酒小鼠的防醉和保护作用，以期找到一种有效的解酒护肝食品或药品，以及为低值海参的高值化利用提供理论依据。

1 材料

1.1海地瓜海地瓜(A.Molpadioides)，购于山东省青岛市南山水产品市场。

1.2实验动物健康ICR小鼠，♂，体质量18～22 g，SPF级，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，合格证号为SCXK(京)2006-2009。

1.3药品与试剂白酒(红星二锅头，乙醇含量56%)为北京红星股份有限公司产品，复方益肝灵片为江苏中兴药业有限公司产品，ALT、AST、ADH、MDA、GSH-Px、CAT试剂盒均为南京建成生物工程研究所产品，ALD试剂盒为长春汇力生物技术有限公司产品，其它试剂为国产分析纯。

1.4仪器GL-20M高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品;数显恒温水浴锅，金坛市双捷实验仪器厂产品;CA-958系列半自动生化分析仪，长春光机医疗仪器有限公司产品;WFJ 2000型可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司产品;Model 680型酶标仪，Bio RAD产品;MP200型电子天平，上海精密科学仪器有限公司产品。

2 方法

2.1海参岩藻聚糖硫酸酯制备海地瓜干品经粉碎、丙酮浸泡脱脂后，室温晾干。将海参干粉与木瓜蛋白酶按10∶1比例混合酶解，离心(4 000 r·min-1，15 min，20 ℃)，向上清液中加入氯化十六烷基吡啶沉淀多糖。将沉淀溶解于3 mol·L-1NaCl∶乙醇(100∶15，V/V)溶液，用体积分数为95%的乙醇沉淀过夜。沉淀分别经体积分数为80%和95%的乙醇洗涤、60℃干燥、蒸馏水溶解、超滤脱盐、浓缩、冻干，得海参粗多糖。将海参粗多糖按1∶30(W/V)溶于 25 mmol·L-1pH 6.3 磷酸缓冲溶液，采用Q sepharose fast flow阴离子交换柱，以2.0～2.5 mol·L-1NaCl溶液(25 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4，pH 6.3)梯度洗脱，流速为 5 ml·min-1。收集、冻干，得 SC-FUC［12-13］。采用 PMP 柱前衍生-HPLC法测得其单糖组成绝大部分为岩藻糖，采用离子色谱法测得其硫酸根含量为26.3%。

2.2动物分组和实验健康♂ ICR小鼠50只，适应性喂养3 d后，按体重随机分为5组，正常对照组(灌服等体积生理盐水)、模型对照组(灌服等体积生理盐水)、益肝灵阳性对照组(150 mg·kg-1·d-1)、SC-FUC 低剂量组(50 mg·kg-1·d-1)、SCFUC(100 mg·kg-1·d-1)高剂量组，每组10只。各组小鼠根据体质量按8 ml·kg-1预灌胃受试物3 d，于末次给药后当晚禁食不禁水8 h，小鼠先灌胃上述剂量受试物，1 h后，药物组和模型对照组小鼠根据体重15 ml·kg-1灌胃白酒，正常对照组灌胃同体积生理盐水。观察小鼠活动情况，记录小鼠翻正反射消失和恢复的时间(即醉酒和醒酒时间)。以小鼠1 min内能否进行3次反正反射为醉酒标准［14］。小鼠灌胃白酒24 h后，摘眼球取血，常规分离血清，备用。快速剥离肝脏，称重，-80℃保存备用。

2.3血清ALT和AST活力测定参照试剂盒方法测定血清ALT和AST活力，结果以卡门氏单位表示。卡门氏单位表示定义:1 ml血清1 min内所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD+引起吸光度每下降0.001为一个单位。

2.4肝脏匀浆液的制备约取肝脏0.3 g，冷生理盐水漂洗，滤纸拭干，将肝脏与冷生理盐水1∶9混合匀浆，离心(8 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，取上清，-80℃保存待测。蛋白含量采用双缩脲法测定。

2.5肝脏有关生化指标的测定肝组织 ADH、ALD、CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量均按试剂盒方法进行测定。

2.6统计学分析数据以±s表示，采用SPSS 11.0软件进行 One Way ANOVA分析，同时进行LSD比较。

3 结果

3.1对小鼠醉酒和醒酒时间的影响由Tab 1可见，SC-FUC低、高剂量均能明显推迟小鼠醉酒时间，SC-FUC低剂量组小鼠醒酒时间较模型对照组提前了19.08%，表明SC-FUC能有效提高小鼠对酒精的耐受能力。

Tab 1 Effects of SC-FUC on the time of ebriety and sobriety of mice(±s，n=10)

Tab 1 Effects of SC-FUC on the time of ebriety and sobriety of mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Time of ebriety/min Time of sobriety/min Model control 5.78 ±1.03 450.00 ±12.06 Positive control 7.13 ±2.67 396.57 ±86.46 SC-FUC low dose 7.86 ±1.64* 364.14 ±103.19 SC-FUC high dose 8.88 ±2.32＊＊418.50 ±43.87

3.2对小鼠血清ALT和AST活力的影响AST和ALT主要分布在肝脏和心肌中，其在血液中活力的高低反映了肝脏的受损伤程度。与正常对照组比较，模型对照组小鼠血清ALT和AST活力分别提高了48.1%和65.3%(P＜0.05)。灌胃 SC-FUC 各剂量组均能明显降低小鼠血清ALT和AST的活力(P＜0.01)，分别较模型对照组小鼠平均降低了37.3%和47.3%，表明SC-FUC能明显拮抗酒精对肝脏的损伤，结果见Tab 2。

3.3对小鼠肝脏ADH和ALD活力的影响ADH和ALD是机体乙醇代谢关键酶，乙醇经ADH催化氧化成乙醛，乙醛再经过ALD催化氧化成乙酸，后者以乙酰CoA的形式进入三羧酸循环，最后氧化成CO2和H2O排出体外［15］。由Tab 2可见，模型对照组小鼠肝脏ADH活力较正常组明显降低，与正常对照组相比，SC-FUC低剂量组小鼠肝脏ADH和ALD活力较模型对照组均有明显升高，分别升高了34.3%(P＜0.01)和45.2%(P＜0.01)。高剂量组的ADH和ALD活力较模型对照组差异没有统计学意义，说明适量SC-FUC能明显促进小鼠肝脏中乙醇的代谢。

3.4对小鼠抗氧化能力的影响由Tab 3可见，SC-FUC能提高小鼠肝脏 GSH-Px、CAT和 SOD活力，降低MDA含量。与模型对照组比较，药物组小鼠的肝脏GSH-Px、CAT和SOD活力平均分别提高了34.4%、17.5%和18%。剂量组小鼠的 MDA含量较模型对照组平均降低34.25%，其中以低剂量组差异有显著性。说明适量SC-FUC能有效提高小鼠肝脏的抗氧化能力。

Tab 2 Effects of SC-FUC on the activities of ALT and AST in mouse serum and ADH and ALD in mouse liver(±s，n=10)

Tab 2 Effects of SC-FUC on the activities of ALT and AST in mouse serum and ADH and ALD in mouse liver(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group

Group ALT/U·L-1 AST/U·L-1 ADH/kU·g-1Pro ALD/kU·g-1Pro Normal control 28.71 ±4.02 23.33 ±4.16 4.38 ±0.34 2.79 ±0.21 Model control 42.53 ±12.48# 38.57 ±11.99## 3.09 ±0.39# 4.84 ±0.74#Positive control 25.13 ±5.54＊＊ 23.30 ±4.86＊＊ 4.54 ±1.00＊＊ 6.25 ±1.18 SC-FUC low dose 27.42 ±9.31＊＊ 21.96 ±6.66＊＊ 4.15 ±0.70＊＊ 7.03 ±1.83*SC-FUC high dose 25.92 ±6.82＊＊ 18.70 ±3.02＊＊3.49 ±0.84 5.67 ±1.04

Tab 3 Effect of SC-FUC on the activities of GSH-Px，CAT，SOD and the content of MDA in mouse liver(±s，n=10)

Tab 3 Effect of SC-FUC on the activities of GSH-Px，CAT，SOD and the content of MDA in mouse liver(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group

Group GSH-Px/kU·g-1Pro CAT/kU·g-1Pro MDA/mmol·g-1Pro SOD/kU·g-1Pro Normal control 524.49 ±61.99 11.70 ±1.43 1.42±0.20 177.69 ±29.28 Model control 420.49 ±73.57# 10.04 ±0.45 3.99 ±1.40## 191.40 ±41.41 Positive control 509.21 ±53.66* 12.54 ±1.33* 2.59 ±0.72* 201.64 ±31.12 SC-FUC low dose 601.19 ±43.98＊＊ 12.83 ±1.56* 2.05 ±0.36＊＊ 233.73 ±10.43 SC-FUC high dose 528.80 ±11.62*10.76 ±2.24 3.2 ±0.93 217.96 ±24.59

4 讨论

目前，研究解酒药物是以降低饮酒者血中乙醇及其代谢产物的浓度，减轻各器官受到的损伤为核心。乙醇被机体吸收后，在ADH的催化下可被脱氢氧化为乙醛。乙醛具有很强的毒性，是导致肝损伤的直接作用者［16］，它能使肝细胞内线粒体受损，在黄嘌呤氧化酶作用下形成超氧化物，引起脂质过氧化，导致肝细胞损伤。另外，乙醛还与蛋白质结合形成乙醛复合体，导致蛋白质功能紊乱，导致肝细胞再次受损［17］。乙醛在肝脏内经ALD继续被氧化成乙酸，最后以乙酰CoA的形式进入三羧酸循环。乙醇代谢的整个过程中有大量活性氧生成，导致肝细胞脂质过氧化反应引起肝细胞损伤［18］。据乙醇在机体内的代谢特点，解酒药物主要从两方面发挥作用:其一、抑制酒精的胃肠吸收，加强乙醇在胃肠道的首过效应;其二、药物直接作用于肝代谢酶系，加速乙醇及其代谢产物的清除速率，减轻其对组织细胞的损害［19］。实验结果显示，SC-FUC能够有效推迟小鼠醉酒时间，缩短醒酒时间，明显提高小鼠肝脏ADH和ALD活力，提示SC-FUC能明显促进乙醇在小鼠体内的代谢，具有明显的防醉和解酒作用。

肝脏是机体含酶最丰富的脏器，当肝脏受到实质性损害时，会引起血清中ALT和AST活性升高。实验结果显示，SC-FUC能明显降低血清中ALT和AST活性，提示SC-FUC具有明显地保肝护肝作用。

SOD、CAT和GSH-Px均为机体重要的抗氧化酶。其中，SOD专一性的清除超氧阴离子自由基，有明显的抗脂质过氧化作用。CAT能阻止H2O2转变为·OH，并使之分解为H2O和O2。GSH-Px也能催化H2O2的分解，降低机体内·OH的水平，从而保护生物膜［20］。大量研究表明，褐藻类岩藻聚糖硫酸酯有明显的抗氧化作用。例如，半叶马尾藻岩藻聚糖硫酸酯［21］、海带岩藻聚糖硫酸酯［22］对自由基具有较高的清除能力。任丹丹等［23］研究发现海带岩藻聚糖硫酸酯对四氯化碳引起的肝损伤小鼠有一定的保护作用。本实验结果显示，SC-FUC能明显提高小鼠肝脏CAT和GSH-Px活力，降低MDA含量，这与褐藻岩藻聚糖硫酸酯的文献报道相似。提示SC-FUC可促进乙醇代谢过程中生成大量活性氧的清除，降低肝细胞的脂质过氧化程度，起到保护肝脏的作用。

综上所述，SC-FUC具有明显的防醉酒、促进醒酒和保护肝脏作用，其作用机制与提高肝脏ADH和ALD活力，加速乙醇的代谢过程，同时提高肝脏抗氧化能力，降低活性氧自由基对肝细胞膜上脂质和蛋白的损伤，维持细胞膜结构与功能完整性有关。SC-FUC是否能够抑制胃肠对酒精的吸收，尚需进一步研究。本实验为SC-FUC作为一种功效因子在功能食品或药品方面的深度开发，以及低值海参的高值化加工和利用提供了理论依据。

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