匹诺塞林对体外共培养海兔SN/L7神经元电生理活动的作用

应 剑，胡江原，陈 阳，Samuel Schacher，杜冠华

(1.中国医学科学院药物研究所国家药物筛选中心，北京 100050;2.美国哥伦比亚大学医学中心神经科学系，纽约 10032)

海洋软体动物海兔(aplysia californica)神经系统简单，神经细胞胞体大且数量少、便于实验操作，是研究学习记忆和神经功能的重要模式生物。20世纪60年代，Kandel等［1］对海兔缩鳃反射的神经通路进行研究，发现来自喷水管的感觉信息经胸膜神经节的感觉神经元SN传至腹部神经节的L7运动神经元，L7支配鳃肌，控制缩鳃运动。80年代，Glanzman等［2］建立了SN和L7的共培养模型(SN/L7)，即分别分离L7和单个SN后，转移至玻璃底培养皿中共同培养，用玻璃微电极将SN和L7的轴突轻轻搭在一起，在适当的培养条件下，SN和L7之间可形成特异的突触连接。

介导SN/L7突触瞬时兴奋传递的递质是谷氨酸［3］。谷氨酸作用于突触后膜的兴奋性氨基酸受体，使突触后膜对Na+、K+的通透性增加，Na+内流大于K+外流，突触后膜局部去极化，从而产生兴奋性突触后电位(EPSP)。在适当条件下，SN/L7可表现出短时程或者长时程的突触可塑性，模拟自然条件下海兔缩鳃反射的习惯化和敏感化。短时程突触可塑性主要依赖于离子通道的修饰和递质释放的变化，通过一系列下游信号通路的转导，还可能对长时程突触可塑性产生影响。

匹诺塞林(PNCB)是蜂胶中含量最高的黄酮类化合物［4］，具有抗炎［5］、杀菌［6－7］、抗氧化［8］、舒张血管［9］、神经保护［10－12］等广泛的药理作用。在药物筛选以及对PNCB抗脑缺血损伤机制的研究中，发现PNCB作用于K+通道、Ca2+通道、NMDA受体、GABA受体等多种离子通道。本实验通过考察PNCB对海兔SN/L7的电生理活动的作用，探讨PNCB对海兔神经细胞短时程突触可塑性和长时程突触可塑性的影响，为PNCB对神经系统作用机制的研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1材料不同年龄段的加州海兔，分别用于分离L7细胞(幼年海兔，体质量2 g)、SN细胞(成年海兔，体质量60～80 g)，抽取淋巴血液(成年海兔，体质量约1 kg)，均购于美国迈阿密大学海兔国家资源库。实验中所用试剂均购于美国Sigma公司。PNCB(纯度大于98%)由中国医学科学院药物研究所吴松教授提供。

1.2SN/L7细胞培养根据SN/L7共培养的实验方法［2］，从成年海兔的胸膜神经节分离SN，从幼年海兔的腹部神经节分离L7。将两个神经细胞移至同一个玻璃底培养皿中，用微电极轻轻拨动轴突，使两个神经细胞的轴突相互接触，并于18℃静置培养。细胞培养基为含50%海兔淋巴血液和100 mmol·L－1L-谷氨酸的L15培养基。共培养体系隔天换液，d 5开始实验。

1.3电生理技术应用全细胞电生理技术记录SN/L7的兴奋性突触后电位(EPSP)［13］。将刺激电极靠近SN的细胞体，设定工作电位为－85 mV，对SN胞体施加电刺激，每个刺激持续0.3～0.5 ms;将记录电极插入L7的细胞体引出EPSP。

1.4匹诺塞林对SN/L7的电生理活动的影响将50%的L15培养基与50%的人工海水(ASW)混合均匀，即 L15/ASW 工作液。精密称取 PNCB，用DMSO 梯度稀释至 10、20、30、40、100、200、300、400 mmol·L－1，使用前再用 L15/ASW 稀释1 000倍待用。细胞培养至d 5时，用L15/ASW轻轻洗去培养基，记录SN/L7的初始EPSP;然后用10ml含不同浓度PNCB的L15/ASW溶液替换L15/ASW，室温静置5 min后，再记录EPSP。对于PNCB给药浓度为0.1～0.4 mmol·L－1的实验组，用L15/ASW充分洗去药物，换成细胞培养基，放回培养箱培养，并分别于 1、24 h 记录 EPSP。另取 0.01 mmol·L－1PNCB孵育过的SN/L7，洗去或不洗去药物，加入0.005 mmol·L－15-HT 溶液孵育5 min，记录 EPSP。

另取一批细胞，于d 5用L15/ASW洗去细胞培养基后，记录 SN/L7的初始 EPSP。再用含0.01 mmol·L－1PNCB 的 L15/ASW 孵育 SN/L7，每 20 min换液1次，共5次。然后用L15/ASW洗去药物，换回细胞培养基于18℃继续培养。d 6重复以上孵育步骤。d 7用L15/ASW洗去细胞培养基后，记录EPSP。

2 结果

2.1匹诺塞林降低SN/L7的兴奋性突触后电位(EPSP)的作用SN和L7转移至玻璃底培养皿后，开始贴壁生长，搭在一起的轴突之间逐渐形成突触。伴随着突触成熟，可以记录到幅值越来越高的EPSP。d 4～5，细胞成熟(Fig 1)，EPSP的幅值也基本稳定［14］。

Fig 1 Typical SN/L7 co-culture at day 1，3 and 5

使用培养至d 5的细胞，考察不同浓度的PNCB对SN/L7的EPSP的影响。以PNCB作用前细胞的初始EPSP幅值为基准值，计算药物作用后的EPSP幅值相对于初始值的百分比。对照组细胞用含0.1%的DMSO的L15/ASW孵育5 min后，用同样的指标计算EPSP幅值的变化。在检测时间内，对照组的EPSP幅值略有增高，但无显著性变化;而PNCB(0.01 ～0.4 mmol·L－1)作用5 min，使 SN/L7的峰电位消失、突触电位降低(Fig 2)。

Fig 2 Normalized EPSP amplitude(%pretreatment baseline)in Aplysia SN/L7 co-cultures after 5 min incubation of 0.01 ～ 0.4 mmol·L-1pinocembrin

当 PNCB浓度低于0.1 mmol·L－1时，其降低EPSP的作用强度与给药剂量呈负相关的线性关系(r＞0.995)。而在 0.1 ～0.4 mmol·L－1的浓度范围内，PNCB降低EPSP的作用强度与给药剂量呈正相关的线性关系(r＞0.998)。当PNCB浓度为0.4 mmol·L－1时，EPSP的幅值仅为初始幅值的(30.7±5.1)%(P＜0.01)。此外，当药物浓度 ＞0.1 mmol·L－1时，细胞静息电位也受到影响，观察到一定程度的去极化。

2.2匹诺塞林可逆性降低EPSP幅值的作用PNCB与海兔神经细胞作用后，洗去含 PNCB的L15/ASW，置换成细胞培养基，于18℃继续培养1 h，EPSP的幅值即回升为初始幅值的71% ～89%;继续培养24 h，则大多数细胞的EPSP幅值恢复至初始值。结果表明，PNCB对海兔神经细胞EPSP幅值的抑制作用是可逆的，将PNCB洗去后EPSP可以得到恢复。而动作电位幅度的恢复与PNCB的浓度无直接关系(Tab 1)。

2.3匹诺塞林抑制SN/L7对5-HT的反应性的作用海兔神经系统通过一个中间神经元释放5-HT至SN和L7的突触连接，易化突触传递。在体外培养体系中，用0.005 mmol·L－1的5-HT刺激细胞，可以使细胞的EPSP升高，甚至出现尖锐的峰电位(Fig 3A)。用 0.02 mmol·L－1PNCB 孵育细胞5min使SN/L7的EPSP幅值下降，再加入5-HT(终浓度为0.005 mmol·L－1)孵育5 min后，未见EPSP幅值升高或峰电位出现(Fig 3B)。撤除PNCB后静置5 min再给予5-HT刺激，则可以记录到EPSP幅值增加或者峰电位(Fig 3C)。

Tab 1 Normalized EPSP amplitude in Aplysia SN/L7 co-cultures after removal of pinocembrin(±s，n=3)

Tab 1 Normalized EPSP amplitude in Aplysia SN/L7 co-cultures after removal of pinocembrin(±s，n=3)

The initial EPSP level of each culture is marked as 100%

Pinocembrin concentration/mmol·L －1 Normalized EPSP amplitude/%0 1 h 24 h 0.1 81.4 ±8.6 77.7 ±23.6 96.7 ±4.7 0.2 62.8 ±12.8 71.5 ±18.2 87.3 ±5.1 0.3 45.4 ±2.6 71.6 ±3.8 106.3 ±0.1 0.4 30.7 ±5.1 88.8 ±9.8 105.8 ±3.0

Fig 3 Pinocembrin inhibited the spike evoked by 5-HT in Aplysia SN/L7 co-cultures.

2.4匹诺塞林对SN/L7长时程突触可塑性的作用

为考察PNCB是否影响SN/L7的长时程突触可塑性，在d 5和d 6分别在细胞培养基中加入0.01 mmol·L－1PNCB，并在 d 6 给药24 h 后记录 EPSP。结果表明，对照组的EPSP幅值为给药前的(104.1±10.5)%;PNCB给药组的EPSP幅值为给药前的(96.6±4.7)%。两个实验组EPSP的变化差异没有显著性。

3 讨论

负责海兔SN/L7突触兴奋性传递的主要递质是谷氨酸。海兔神经细胞的突触后膜上存在NMDA、AMPA型等谷氨酸受体［15］。本实验证明，给予5 min 0.01～0.4 mmol·L－1PNCB 的刺激，可抑制海兔SN/L7的电生理效应，使EPSP幅值降低。这一现象表明，PNCB对SN/L7的兴奋性突触传递有一定程度的抑制作用，其抑制SN/L7突触的兴奋性的作用可能与NMDA型谷氨酸受体有关。

以0.1 mmol·L－1为转折点，抑制作用呈现两相性，即PNCB 的浓度在0.01～0.1 mmol·L－1的范围内，抑制作用随着药物浓度增加而减弱;而当PNCB的浓度在0.1～0.4 mmol·L－1的范围内时，抑制效应随着药物浓度增加而增强。且这两相均呈现良好的线性相关性。因此，PNCB抑制SN/L7兴奋性突触传递的作用在不同浓度下可能有不同的机制，需要进一步研究。近几年的研究发现，神经细胞NMDA受体可分为突触型(NMDARs)与非突触型(NMDARn)两类。NMDA抑制剂，如美金刚等，在低浓度时优先抑制NMDARn，对NMDARs的抑制较弱，使得NMDARs相对活化;随着抑制剂的浓度增加，NMDARs才被明显抑制［16］。这一现象有助于解释本实验中观察到的PNCB抑制海兔SN/L7 EPSP的两相性。

神经细胞SN/L7与PNCB作用后，撤除PNCB可以使神经细胞的EPSP幅值恢复至初始值。这一结果提示，PNCB对其作用靶点的抑制作用是可逆的。

5-HT有易化SN/L7神经突触的作用。生理状态下，用0.005 mmol·L－15-HT孵育SN/L7共培养体系5min，即可记录到EPSP增强。PNCB的作用使SN/L7对5-HT的反应性消失;而撤除PNCB后，这一反应性迅速得以恢复，提示PNCB对5-HT易化神经突触的通路也有可逆的抑制作用。用5-HT刺激体外SN/L7共培养细胞，模拟的是海兔缩鳃反射的敏感化。5-HT作用于SN/L7的突触前膜，激活腺苷酸环化酶，继而使蛋白激酶磷酸化，磷酸化的蛋白激酶作用于突触前膜的钾离子通道使之关闭，钾离子外流减少，使动作电位到来之前的去极化时间延长，从突触前膜释放的谷氨酸增加，EPSP的幅值随之增加，突触效能增强［17－18］。因此，PNCB 可逆地抑制SN/L7共培养体系对5-HT的反应性，可能与PNCB对突触后膜谷氨酸受体的可逆性抑制有关;此外，由于PNCB具有开放钾离子通道的作用［9］，PNCB也可能通过开放突触前膜的钾离子通道，减少谷氨酸释放，实现其抑制作用。

模拟5-HT诱导长时程易化的实验方法，连续两天用0.01 mmol·L－1PNCB孵育SN/L7细胞，24 h后 SN/L7的 EPSP幅值没有明显变化。表明PNCB对NMDA受体的抑制作用未在基因和蛋白水平产生更深远的影响。

此外，实验中还观察到高浓度PNCB影响L7静息电位，表现为部分去极化，表明高浓度PNCB可能在突触后膜影响钾离子外流或钠离子内流。由于有研究证明PNCB可开放钾离子通道，因此，PNCB可能通过部分开放L7细胞膜上的钠离子通道，影响其静息电位。

综上所述，PNCB作用于其SN/L7模型，总体表现为对突触兴奋性传导的可逆性抑制。但是，在实验剂量下，PNCB不影响SN/L7的长时程突触可塑性。PNCB是一种药理作用广泛的化合物。本实验室在研究PNCB作用机制的工作中，发现PNCB与一系列病理通路关联。其中，PNCB抗脑缺血损伤的作用与NMDA受体相关。但是，PNCB药理作用的靶点究竟何在，仍然未有定论。本研究提示，PNCB可能通过作用于突触前膜和突触后膜的多种离子通道，产生复杂的瞬时效应以及下游效应。下一步工作将深入探讨PNCB对离子通道的作用，相信不日将寻得PNCB的作用靶点。

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