环磷酰胺对胚胎大鼠脑发育的毒性作用

谢明仁，郑高键，高国富，张 璐，连秀珍，张 琛

(甘肃政法学院公安分院，甘肃兰州 730070)

随着化学用品、化学药物在人类生活中的广泛应用，其安全问题已经引起世界各国的高度重视。据文献［1］报道，几乎所有的化学药物在对母体产生毒性的同时就引起胎儿发育减慢、畸形(四肢缺损、中枢神经系统缺损、无肾等)、甚至死亡。据不完全统计，因化学药物导致胎儿畸形发生率在国外占20% ～30%，国内占14.8%［2］。本文以 Wistar孕鼠为对象，就环磷酰胺对胎鼠脑发育的影响进行了实验研究，以期为环磷酰胺的临床应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1实验药品、试剂环磷酰胺(cyclophosphmide，CP):由山西普德药业有限公司生产，批号:20090103。兔抗Bax、SABC免疫组化试剂盒、DAB显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)、SP卵白素试剂盒、EDTA液(北京中杉生物工程有限公司)。YA-G5000系列医学细胞影像分析软件(徐州永安科技发展有限公司)。

1.2实验动物和给药方法实验动物:健康性成熟未育Wistar大鼠90只(♀60只，♂30只)，体质量220～230 g，购于甘肃省医学科学研究院实验动物中心，动物质量合格证号:医动字14-008。

全部动物在SPF级实验室饲养适应7 d，按♀ ∶♂=2∶1合笼饲养，室温18～23℃。合笼后次日早晨作阴道精子涂片检查，有精子者为已交配，当日作为“受孕”0 d。将查出的孕鼠按照妊娠时间随机分为4组，每组15只。A组:妊娠d 7-9，腹腔注射CP;B组:妊娠d 10-12腹腔注射CP;C组:妊娠d 13-15腹腔注射CP;D组:妊娠d 7-15腹腔注射等量的生理盐水。给药组又分为5、8、16 mg·kg－1体重3个剂量组。各组每天给药1次。妊娠d 20，手术解剖出胎鼠，用4%的多聚甲醛－1.25%戊二醛固定，备用。全部实验均在甘肃省证据科学技术研究与应用重点实验室(甘肃政法学院)培育基地完成。

1.3Bax的免疫组织检测取固定后的胎鼠大、小脑组织，常规脱水、包埋、切片。Bax的免疫组织检测按SABC免疫组化试剂盒说明书操作。光镜观察，显微拍照并进行图像分析。

1.4图像分析用YA-G5000系列医学细胞影像分析软件进行图像拍照及其分析。从每组免疫组织化学切片中各选5张形态典型对应切面，测量积分吸光度(IOD，指所测结构范围内各像素光密度值之和，可反映所测结构的光密度与面积的综合变化)、平均吸光度(MA，指被测个体的截面内各像素的光密度值的算术平均，即为整个视野中每一点的光密度的叠加除以点数的总和，可反映组织细胞被染色的深浅)。Bax染色阳性物质呈深浅不一的棕黄色颗粒，主要定位于细胞膜、细胞质及核膜中。

1.5统计学处理实验数据采用SPSS10.0软件完成统计处理。组间差异比较采用t检验分析。

2 结果

2.1环磷酰胺对胎鼠大脑皮层中Bax表达的影响光镜发现:与对照组比，给药组胎鼠大脑皮层细胞胞体体积减小，呈圆球形，细胞之间的突触联系减少，免疫阳性细胞呈弥漫或颗粒状，胞核浓缩或碎解成小块。其中A2组较其他各组明显，呈强阳性反应。细胞影像分析发现:给环磷酰胺8 mg·kg－1体重 (A2、B2、C2 组)孕鼠组:随给药时间的提前，胎鼠大脑皮层中Bax的阳性表达增强，表现为:A2＞B2＞C2组，与对照组比差异有显著性(P＜0.01);5 mg·kg－1体重(A1、B1、C1组)孕鼠组，随给药时间的提前，胎鼠大脑皮层中Bax的阳性表达虽有增强趋势，但差异无统计学意义(P＞0.05);16 mg·kg－1体重孕鼠组，未见成形胚胎。见Tab 1。

2.2环磷酰胺对胎鼠小脑皮层中Bax表达的影响光镜发现:A2组胎鼠小脑皮层中Bax表达强于其它各组，阳性细胞分布密集，胞体着色深，胞质和胞核均有表达。细胞影像分析发现:给环磷酰胺5、8 mg·kg－1体重孕鼠组:胎鼠小脑皮层中Bax表达随给药时间的提前而增强，与对照组比差异有显著性(P＜0.05～0.01);16 mg·kg－1体重孕鼠组，未见成形胚胎。见Tab 2。

Tab 1 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebral cortex of fetal rats(±s，n=5)

Tab 1 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebral cortex of fetal rats(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs D group

Index A1 A2 B1 B2 C1 C2 C3 D IOD 9.0 ±0.1* 12.8 ±0.4＊＊ 7.3 ±0.7 10.6 ±0.9* 6.7 ±0.9 6.9 ±0.8 9.4 ±0.2*5.1 ±0.7 MA 0.218 0.310 0.176 0.256 0.163 0.169 0.227 0.140±0.007* ±0.002＊＊ ±0.008 ±0.006* ±0.002 ±0.004 ±0.006*±0.006

Tab 2 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebellum cortex of fetal rats(±s，n=5)

Tab 2 Effect of cyclophosphamide on the expression of Bax in the cerebellum cortex of fetal rats(±s，n=5)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs D group

Index A1 A2 B1 B2 C1 C2 C3 D IOD 7.2 ±0.2* 10.5 ±0.1＊＊ 7.2 ±0.7* 5.5 ±0.3* 4.9 ±0.7 4.9 ±10.3 9.7 ±0.7*4.2 ±0.9 MA 0.174 0.263 0.206 0.133 0.119 0.119 0.234 0.109±0.003* ±0.004＊＊ ±0.003* ±0.005* ±0.001 ±0.007 ±0.005*±0.003

3 讨论

目前，临床应用的抗肿瘤药物种类繁多［3］，它们在抑制肿瘤生长的同时也严重影响患者的健康，还严重影响胚胎发育程序［4］，影响胚胎出生后幼仔的远期损伤。环磷酰胺是一种临床上常用的抗癌药，是细胞周期非特异性的广谱抗肿瘤药［5］，它进入肿瘤细胞后能分解出磷酰胺氮芥，与DNA发生烷化，形成交叉联结，干扰DNA及RNA功能，抑制肿瘤细胞的生长繁殖。环磷酰胺同时又是一种公认的诱变剂，能致正常细胞突变，对造血系统和免疫功能［6］具有明显的抑制作用，使外周血白细胞和骨髓有核细胞明显减少，CD4/CD8 T淋巴细胞亚群比值降低。生殖系统对化学毒物的作用十分敏感，在其他系统还未出现毒性反应之前，生殖系统可能已受损害。据统计，环磷酰胺对中青年性腺抑制发生率达12%～83%，在女性，主要是低雌激素血症引起的更年期症状，表现为潮热、阴道干燥、性欲下降、月经不调、闭经、卵巢功能早衰(40岁前绝经)、不育、失眠及抑郁等;在男性，引起精子缺乏，降低睾丸间质细胞功能，严重影响患者的生活质量。实验结果证明，环磷酰胺明显抑制胎鼠骨骼发育和脑的形成，导致脑畸形发育［7］。本文在大鼠胚胎发育的不同时间给予不同剂量的环磷酰胺，胚胎发育d 20解剖出胎鼠，发现，给予孕鼠16 mg·kg－1体重环磷酰胺后，未见成形胚胎。在受孕d 7-9，分别给予5、8 mg·kg－1体重环磷酰胺，胎鼠大、小脑皮层中Bax表达比d 13-15给药明显增强(P＜0.01)。结果显示，环磷酰胺对胚胎发育有明显的毒性作用，其毒性随给药浓度增大和给药时间的提前而增强。本实验结果为环磷酰胺的临床应用提供了参考依据。

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