橘红素增强5-氟尿嘧啶抑制人胃癌AGS细胞增殖的作用及其机制研究

鲁 岚，董 杨，施建蓉，吴大正

(上海中医药大学1.中药研究所、2.上海市复方中药重点实验室、3.教学实验中心，上海 201203)

5-氟尿嘧啶(5-Fu)是临床常用的一线抗肿瘤药物，尤其用于消化道肿瘤［1］。然而5-Fu可造成恶心、疲劳、血细胞减少以及心血管毒性等副作用却限制了其临床使用，因此降低使用剂量以减轻副作用对于5-Fu的推广使用有重要意义［2－3］。近年来，与无毒的植物药成分联用增强5-Fu的抗肿瘤作用成为研究者关注的热点［4］。橘红素(Tangeretin)是一种存在于橘皮、枳实中的天然多甲氧基黄酮成分，已有研究报道橘红素对多种肿瘤细胞如结肠癌、乳腺癌、肺癌等均有抑制作用，且没有明显细胞毒性［5－6］。本研究观察橘红素和小剂量5-Fu联用对人AGS胃癌细胞增殖的抑制作用，并初步探讨其作用机制。

1 材料

1.1细胞株人胃癌AGS细胞株购自美国ATCC(American Type Culture Collection)。

1.2药物与试剂橘红素(纯度 ＞98%，批号:09102121)购自上海同田生物技术有限公司，5-氟尿嘧啶(5-Fu，批号:100410)为上海旭东海普药业有限公司产品。HAM's/F12培养基(批号:NVF0282)为Hyclone公司产品;胎牛血清(批号:091214)购自杭州四季青生物工程材料有限公司;MTT(批号:091205)购自上海日初生物科技有限公司;碘化丙啶(PI，批号:118K3538)购自美国 Sigma公司;0.25%胰酶(批号:15050)购自美国 Gibco公司;ECL plus购自美国GE Healthcare公司;p21、p53、βactin一抗为美国CST公司产品。

1.3仪器Molecular Device SPECTERAmax 190酶标仪(美国)，BD FACSCalibur流式细胞仪(美国)，BRANSON超声细胞破碎仪(美国)，Bio-Rad水平、垂直电泳及转膜装置(美国)。

2 方法

2.1细胞培养人胃癌AGS细胞株接种于含10%胎牛血清的HAM's/F12培养液，置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养。

2.2MTT检测对细胞抑制作用取对数生长期的AGS细胞，以1.0×107·L－1的密度接种于96孔培养板，每孔加入200 μl用培养液配制的5-Fu，橘红素以及5-Fu和橘红素联合，对照组为培养液或0.05%DMSO，培养24 h 后，每孔加 MTT 20 μl(5 g·L－1)，4 h后弃上清，加入 150 μl DMSO 震荡 10 min，酶标仪检测570 nm的吸光度，实验重复3次。抑制率/%=(1－受试药 OD值/对照 OD值)×100%。

2.3流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期AGS细胞，以2.5×107·L－1的密度接种于6孔培养板，药物作用24 h后收集细胞，无水乙醇(－20℃预冷)4℃固定过夜。含 EDTA的PBS洗3次，离心，500 μl PI(50 mg·L－1)避光染色30 min，流式细胞仪检测分析。

2.4Western blot检测蛋白表达药物作用24 h后，收集细胞，加150 μl细胞裂解液，超声粉碎，离心，取上清。分别取50 μg样品蛋白/孔上样，12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白，湿转75 min(4℃，100 V)，5%脱脂奶粉封闭2h，然后分别用βactin(1∶1 000)、p21和p53(1∶500)一抗4℃平摇过夜，HRP标记二抗(1∶5 000)避光孵育2 h，ECL Plus显色液显色，显影、定影，扫描条带并行分析，以目的条带与β-actin条带吸光度的比值作为目的蛋白的相对表达量。

2.5统计学分析数据以±s表示。PrismDemo 4.0统计软件进行统计分析，one-way ANOVA和Dunnett检验进行多组比较。

3 结果

3.1橘红素增强5-Fu抑制AGS细胞增殖的作用

观察1、3、10、25、50、100、200 μmol·L－1浓度的5-Fu作用24 h对AGS胃癌细胞的作用。实验结果显示，OD值随着药物浓度的增加逐渐降低，与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05，P＜0.01)，药物抑制率逐渐增强(Tab 1，Fig 1A)。本课题组前期研究表明，10、30、60 μmol·L－1橘红素可呈剂量依赖地抑制AGS细胞生长，因此，本实验观察小剂量(10 μmol·L－1)和中剂量(30 μmol·L－1)橘红素与 3 μmol·L－1小剂量5-Fu联用对 AGS细胞增值的影响。结果显示，10和 30 μmol·L－1橘红素与 5-Fu联用对AGS细胞增殖的抑制率分别为(42.0±5.3)%和(57.3±3.5)%，均高于5-Fu组(30.4±6.0)%，差异有统计学意义(P＜0.01)。30 μmol·L－1橘红素的增强作用更为明显，因此选用此浓度做进一步的机制研究。见Fig 1B。

Tab 1 The OD570values of AGS cells exposed to 5-Fu at 24 h(±s，n=7)

Tab 1 The OD570values of AGS cells exposed to 5-Fu at 24 h(±s，n=7)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group

Group Concentration/μmol·L －1 OD570 Control 0 0.762 ±0.083 5-Fu 1 0.625 ±0.025*3 0.512 ±0.043＊＊10 0.420 ±0.029＊＊25 0.374 ±0.049＊＊50 0.346 ±0.034＊＊100 0.344 ±0.026＊＊200 0.340 ±0.025＊＊

Fig 1 Tangeretin enhances the inhibiton of 5-Fu on the proliferation of AGS

3.2橘红素联合5-Fu对AGS细胞周期的影响作用24后，5-Fu组G1期细胞百分比高于对照组(P＜0.05)，橘红素组S期细胞百分比高于对照组(P＜0.01)，而橘红素联合5-Fu组S期细胞所占百分比明显增高，与对照组比较差异有显著性(P＜0.01)，提示橘红素联合5-Fu可使AGS胃癌细胞阻滞于S期(Fig 2)。

3.3橘红素联合5-Fu对p53和p21蛋白表达的影响Western blot观察橘红素与5-Fu联用对p53和p21蛋白表达的影响。实验结果显示，作用24 h，橘红素与5-Fu联用可明显增强p53和p21蛋白的表达，且明显高于5-Fu组，差异有统计学意义(P＜0.01)。见Fig 3。

4 讨论

5-Fu为一种抗代谢类抗肿瘤药物，主要通过阻断尿嘧啶脱氧核苷向胸腺嘧啶脱氧核苷的转变影响细胞内的DNA与RNA的合成 ，引起肿瘤细胞崩解、坏死，抑制肿瘤生长［7］。本研究表明，5-Fu可呈剂量依赖地抑制AGS胃癌细胞的增殖，但达到一定浓度，则抑制作用无明显增加。以往研究也显示［4，7］，随着 5-Fu 浓度增加，其副作用明显增强而抗肿瘤作用增加不再明显。因此，通过与无毒的植物药成分联用增强5-Fu疗效，进而降低其使用剂量以达到降低毒副作用的目的有着重要的临床意义。本研究观察到30 μmol·L－1橘红素与小剂量5-Fu(3 μmol·L－1)联用可明显增强5-Fu抑制AGS胃癌细胞增殖的作用，与 100 μmol·L－15-Fu作用相当。因此，橘红素可能作为一种增效剂用于5-Fu抗肿瘤治疗的方案优化。

肿瘤发生的主要原因是细胞周期失调后导致的细胞无限制增殖，因此，调控细胞周期是抑制肿瘤细胞增殖的重要途径。本研究表明，5-Fu主要使AGS细胞阻滞于G1/M期，而橘红素及与5-Fu联用主要使细胞阻滞于S期，二者机制有所不同，这也可能二者联用并未出现协同作用而只是增效作用的原因。S期检查点的机制目前还不十分清楚，但有大量研究表明［8－9］许多化合物抑制肿瘤细胞增殖的作用均与S期阻滞有关。有研究表明［10］哇巴因和华蟾毒配基可使肝癌HepG2细胞p21CIP1表达上调引起细胞周期S期阻滞。本研究也发现，橘红素和5-Fu联用可明显增强p53和p21Cip1/Waf1表达。AGS胃癌细胞系属p53野生型细胞系，野生型p53基因为抑癌基因，细胞受损后，p53可上调p21表达，从而抑制Cyclin-CDK对Rb蛋白的磷酸化作用，使细胞发生 S期阻滞［11－12］。综上所述，橘红素和5-Fu联用可明显增强5-Fu抑制人胃癌AGS细胞增殖的作用，主要机制可能是通过上调p53和p21蛋白使AGS胃癌细胞阻滞于S期。

Fig 2 Effect of tangeretin combined with 5-Fu on AGS cell cycle distribution(n=3)

Fig 3 Effects of tangeretin combined with 5-Fu on p53(A)and p21(B)protein expression(n=3)

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