钙拮抗剂对缺氧/复氧心肌细胞早期生长反应基因的作用及抗损伤的研究

郑付春，黄展勤，石刚刚

(汕头大学医学院1.第一附属医院药剂科、2.医学院药理学教研室，广东汕头 515041)

Ca2+是细胞信号传导过程中最常见的“第二信使”，调节各种生理病理过程。有研究者认为细胞内Ca2+浓度升高可引起Egr-1过量表达［1］，Ca2+可通过不同信号传导途径调节Egr-1的表达［2－3］。我课题组合成的专利化合物碘化N-正丁基氟哌啶醇(F2)具有良好的拮抗心肌缺血/再灌注(I/R)损伤的作用［4－5］，此作用与其阻断心肌细胞和血管平滑肌细胞膜钙通道，防止钙超载有关［6－7］。进一步研究发现F2可明显抑制I/R心肌组织Egr-1 mRNA及蛋白表达水平的升高，并同时减轻心肌组织炎性反应及改善心肌功能［8］，表明对I/R状态下心肌组织内Egr-1过量表达的抑制可能是F2抗I/R损伤的分子机制之一［9］。结合上述概念及报道，具有钙拮抗作用的药物是否与F2一样都可通过抑制Egr-1表达，从而对I/R损伤心肌组织起到保护作用呢，本实验采用3种不同结构类型的常用钙离子拮抗剂:维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平，探讨它们对缺氧/复氧(H/R)心肌细胞损伤及Egr-1基因和蛋白表达的影响，进一步揭示钙离子拮抗剂的作用机制。

1 材料与方法

1.1仪器和试剂CO2培养箱(Thermo Forma公司，美国);酶标仪(Thermo Labsystems公司，芬兰);聚丙烯酰胺凝胶电泳相关材料(Bio-RAD公司，美国);全自动PCR扩增仪(MJ，美国);凝胶成像分析系统(Bio-RAD公司，美国);维拉帕米(恒瑞医药股份有限公司，中国);硝苯地平、地尔硫卓(Sigma，美国);TRIzol试剂、PCR 试剂盒(Invitrogen，美国);肌钙蛋白测试试剂盒(BAYER公司，德国);ELISAS试剂盒(Bender Medsystems公司，瑞士);Egr-1一抗(Santa Crutz公司，美国);辣根过氧化物酶标记的二抗(中杉金桥生物工程公司，中国)。

1.2原代心肌细胞培养1～3 d SD大鼠(汕头大学医学院动物中心提供)，♀♂不拘，固定于无菌操作台上。开胸取心室组织，剪碎至沙粒大小，加入10倍体积的质量分数0.1%胰蛋白酶，37℃消化10 min，组织块沉降后弃上层液体。组织块中继续加入0.1% 的胰蛋白酶，37℃消化10 min，收集上层液体并及时用预冷的体积分数15%小牛血清的培养基灭活残留胰酶活性;上述消化、收集过程反复4～5次。细胞混悬液，接种至容积为50 ml的培养瓶中，37℃培养30 min以使成纤维细胞贴壁。转移细胞悬液，接种至培养瓶和96孔板内，同时加入5-BrdU使其终浓度为 0.1 mmol·L－1［6－7］，置 CO2培养箱培养。隔日换液，d 4后培养基改用不含5-BrdU的培养基。

1.3H/R模型的建立及实验分组:细胞先换用被高纯氮气饱和30 min的缺氧液(137 mmol·L－1NaCl，12 mmol·L－1KCl，0.49 mmol·L－1MgCl2，0.9 mmol·L－1CaCl2·H2O，4 mmol·L－1HEPES，20 mmol·L－1Na lactate)［10］，根据培养容器的大小充入纯氮气，置于缺氧箱中37℃密闭培养3 h，继续在正常培养基中按常规培养条件培养1 h，造成复氧损伤。取培养 d 5～6的心肌细胞随机分为对照(Control)组、H/R组、DMSO组、维拉帕米(Ver)组、地尔硫卓(Dil)组、硝苯地平(Nif，用DMSO溶解)组。H/R做缺氧/复氧模型;Ver组、Dil组、Nif组及DMSO组于缺氧液及复氧液中分别给予Ver(2 μmol·L－1)、Dil(10μmol·L－1)、Nif(10 μmol·L－1)及等容积的DMSO。Control组则于实验前4 h换用体积分数15% 新生牛血清的培养基，CO2培养箱继续培养。

1.4RT-PCR总RNA的提取用TRIzol试剂法提取总RNA。应用紫外分光光度计进行RNA的浓度、纯度测定，通过1% 琼脂糖凝胶电泳进行RNA样品完整性的检测。RT-PCR反应取0.2 ml EP管加入总 RNA 2 μg、随机引物 1 μl，用无核酸酶水补足至12 μl，70℃孵育5 min后分别加入反应缓冲液4 μl、Ribonuclease inhibitor 1 μl、dNTP 2 μl，25℃ 孵育5 min后加入Revert Aid TM H Minus M-Mulv RT 1 μl，混匀后稍离心，25℃，10 min;42℃，60 min;70℃，10 min，合成cDNA。取0.2 ml EP管加入cDNA 1 μl、2 × Master Mix12.5 μl、应用 β-actin 作为内参照，方法同上仅应用引物为β-actin正义及反义序列，PCR 条件:94℃，3 min;94℃，30 s;55℃，30 s;72℃，1 min;72℃，5 min。扩增30个循环。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统进行拍照和图像分析。

1.5Egr-1蛋白测定培养瓶中的细胞PBS洗涤2次，用质量分数0.25% 胰蛋白酶和质量分数0.2%乙二胺四乙酸(V/V，1∶1)消化收集，再次加入PBS漂洗2 次，1 000 r·min－1，离心 10 min(4℃)，弃上清液，沉淀中加入适量的单去污裂解液，冰上裂解30 min。12 000 r·min－1，离心 10 min(4℃)，取上清液，采用Bradford法测定蛋白浓度。加入5×上样缓冲液，100℃变性4 min后备用。配制质量分数10% 的分离胶与质量分数5% 的浓缩胶，完全凝固后，每泳道加60 μg蛋白样品，经电泳(125 V，80 min)和转膜(350 mA，60 min)后，在封闭液中封闭1 h，然后加入1∶200的Egr-1抗体稀释液，4℃过夜，缓冲液洗膜3次，每次10 min，再加1∶1 500的二抗稀释液室温孵育2 h，洗膜3次，每次10 min，加化学发光试剂于膜上，反应1 min，压片，曝光后将胶片进行显影、定影。

1.6心肌细胞损伤及自由基指标测定比色法测定心肌细胞培养上清液中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性;硫代巴比妥酸法测定心肌细胞丙二醛(MDA)的含量;黄嘌呤氧化酶法测定心肌细胞超氧化物歧化酶(SOD)的活性。

1.7统计学处理实验结果用SPSS11.0统计软件分析，结果以±s表示，采用单因素方差分析进行组间的比较。

2 结果

2.1维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平对Egr-1 mRNA表达水平的影响以Egr-1和β-actin光密度值的百分比来反映各组Egr-1 mRNA的转录水平。与Control组相比，H/R组及DMSO组培养大鼠心肌细胞Egr-1 mRNA的表达水平明显增高(P＜0.01)，Ver组、Dil组及Nif组Egr-1 mRNA的表达较H/R组明显下调，差异具有统计学意义(P＜0.05)。

Fig 1 Effects of verapamil，diltiazem and nifedipine on expression of Egr-1 mRNA in rat cardiomyocytes

2.2维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平对Egr-1蛋白表达水平的影响以H/R组的灰度值为100%则Control组、DMSO 组、Ver组、Dil组及 Nif组的灰度值分别为(13.56±2.99)%、(99.93±18.14)%、(32.94±7.68)%、(36.89±6.05)% 和(68.84±14.16)%。其中，与Control组比，H/R组和 DMSO组Egr-1蛋白表达增高，差异具有统计学意义(P＜0.05)，与H/R 组比，Ver组、Dil组及Nif组Egr-1蛋白表达明显减少(P＜0.05)。

Fig 2 Effects of verapamil，diltiazem and nifedipine on expression of Egr-1 protein in rat cardiomyocytes

2.3维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平对培养心肌细胞上清液中CK、LDH活性的影响与Control组比，H/R组及DMSO组培养上清液中CK、LDH活力明显升高，差异具有显著性(P＜0.01)。与H/R组比，Ver组、Dil组及Nif组CK、LDH活性均减弱(P＜0.01)。

Tab 1 Comparison of CK and LDH level of cultured medium(±s，n=15)

Tab 1 Comparison of CK and LDH level of cultured medium(±s，n=15)

＊＊P＜0.01 vs control group;##P＜0.01 vs H/R group

Group CK/kU·L－1 LDH/kU·L －1 Control 12.64 ±2.89 3019.84 ±297.4 H/R 57.18 ±9.32＊＊ 6940.04 ±407.7＊＊DMSO 55.04 ±5.16＊＊ 7003.74 ±570.3＊＊Ver 23.12 ±5.07## 3855.27 ±233.3##Dil 26.48 ±6.15## 4185.66 ±316.7##Nif 32.36 ±7.40## 4564.02 ±402.4##

2.4维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平对心肌细胞中SOD活性和MDA含量的影响与Control组比，H/R组及DMSO组心肌细胞中SOD活力明显降低，MDA含量明显升高，差异具有显著性(P＜0.01)。与H/R组比，Ver组、Dil组及Nif组MDA含量降低(P＜0.01)，SOD 活力增高(P＜0.05)。

Tab 2 Comparison of SOD and MDA level of cultured cardiomyocytes(±s， n=12)

Tab 2 Comparison of SOD and MDA level of cultured cardiomyocytes(±s， n=12)

＊＊P＜0.01 vs control group;#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group

Group SOD/kU·g－1Pro MDA/μmol·g－1Pro Control 29.15 ±7.63 0.20 ±0.05 H/R 15.08 ±2.08＊＊ 0.99 ±0.29＊＊DMSO 16.14 ±2.29＊＊ 1.02 ±0.28＊＊Ver 26.99 ±8.03## 0.41 ±0.11##Dil 25.26 ±7.19## 0.44 ±0.14##Nif 20.80 ±6.37# 0.61 ±0.18##

3 讨论

大量文献报道，Egr-1的高表达与I/R损伤密切相关。采用基因敲除或反义寡核甘酸技术，为Egr-1的诱导和I/R损伤之间的因果关系提供了直接的证据［10－11］。实验结果表明，I/R可诱导的 Egr-1表达上调，异常表达的Egr-1又可进一步诱导一系列下游基因的表达，包括白细胞介素(IL)1、巨噬细胞炎性蛋白2(MIP2)、细胞间黏附分子1(ICAM1)、组织因子(TF)、纤溶酶原激活物抑制剂1(PAI1)和血管内皮生长因子(VEGF)等，这些因子随后启动的炎性反应、凝血和血管高通透性正是I/R组织损伤的三大典型病理变化［10－11］。我们以往的研究与Yan等［10］研究结果基本一致，表明Egr-1的表达上调可能是I/R组织的一种共性表现。

心肌H/R损伤的发生与细胞内钙超载有密切关系。钙超载是指Ca2+在细胞内大量积聚，引起组织器官严重的结构及功能障碍，是心肌H/R损伤的特征之一。有不少文献报道［12］，心肌I/R损伤时应用钙离子拮抗剂能拮抗这些损伤，从而对心肌起到良好的保护作用，改善心功能。本实验的结果亦显示，维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平3种经典的钙通道拮抗剂都能抑制心肌酶LDH和CK的释放，降低H/R心肌细胞内的MDA含量，提高SOD活性，防止细胞内氧自由基的过量产生，减轻心肌细胞的脂质过氧化，从而起到对H/R心肌细胞的保护作用。结果显示，H/R所致的心肌细胞Egr-1 mRNA和蛋白的过量表达可被维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平所抑制，Ca2+可通过不同的机制直接或间接影响Egr-1的转录表达，这可能是钙离子拮抗剂保护心肌细胞(H/R)损伤的共同机制之一。

本实验采用H/R心肌细胞作为模型观察维拉帕米、地尔硫卓和硝苯地平对Egr-1的调节及心功能的作用。较比心肌组织的观察，条件更易控制，结果更加精确可靠，充分验证了心肌组织的结果。从结果看，它们的作用大小并不完全相同，维拉帕米对Egr-1 mRNA和蛋白的抑制率分别为71%、67%，地尔硫卓为66%、63%，两种作用基本相同，硝苯地平为35%、32%，作用相对较弱;心肌细胞损伤指标测定结果也出现相同趋势。这可能与3种拮抗剂各自的作用机制有关，尽管3种药物都是L型钙通道拮抗剂，都能通过抑制Egr-1 mRNA和蛋白表达拮抗心肌细胞H/R损伤，其中维拉帕米、地尔硫卓主要作用于心肌细胞的L型钙通道，而硝苯地平主要作用于血管平滑肌细胞的L型钙通道，对心脏的直接作用较小。钙作为Egr-1表达的上游调控因子，由于上述钙拮抗剂对不同组织的钙通道的阻断强度不一，也就造成了Egr-1表达的差异，这可能是导致拮抗心肌细胞损伤不同的原因之一。另外，预实验表明，维拉帕米、硝苯地平和地尔硫卓的浓度分别2、10及10 μmol·L－1时作用较强，本实验中各拮抗剂采用以上浓度。

我课题组前期F2的研究和本实验的结果提示我们在研究钙拮抗剂作用于“第二信使”钙离子时，应进一步研究它对核转录因子(第三信使)及下游因子的作用，这对于详尽探讨钙拮抗剂作用机制将是非常有意义的。

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