栀子苷对缺氧/复氧小胶质细胞TLR4通路的影响

侯金才，张 鹏，刘建勋，韩 笑，李 丹，王秀辉

(中国中医科学院西苑医院实验中心，北京 100091)

缺血缺氧是脑缺血重要的病理进程，预防和治疗脑缺血时的炎症反应是治疗脑缺血的关键。TLR4已被证明在脑缺血时引起局部组织炎性反应的重要受体，它介导细胞的天然免疫过程［1］。小胶质细胞是脑组织只中的免疫细胞，它的活化使局部组织产生一系列的级联反应。因此，本实验对原代培养的小胶质细胞进行缺氧/复氧，模拟脑缺血时脑组织内缺血缺氧微环境，借以激活TLR4通路，然后用清热解毒中药栀子的有效提取物栀子苷(geniposide)进行干预，从TLR4信号通路探讨栀子苷治疗脑缺血的机制。

1 材料与方法

1.1动物和主要试剂新生SD大鼠(出生24 h内)，级别 SPF/VAF，动物合格证号:SCXK-(京)2006-0009，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

DMEM/F12培养基:Gibco公司;胰蛋白酶:Sig-ma公司;CD11b抗体:Chemicon公司，羊抗小鼠IGFITC与羊抗兔IG-TexRed均购于北京博奥森生物公司。TLR4、MyD88、pI-κB、NF-κBp65、p38 和 p-ERK1/2抗体均购于Abcam公司。栀子苷(纯度95.2%，批号110715-200212，中国药品生物制品检定所)。

1.2大鼠小胶质细胞的培养无菌条件下取出新生大鼠双侧大脑半球，置于预冷的解剖液中，迅速剥除脑膜，剔除髓质的大部分，置于添加了5%胎牛血清的DMEM/F12中，剪碎成1 mm3的组织块，1 000×g离心10 min，弃去上清，用0.25%胰酶+1 mmol·L－1EDTA的消化液于37℃中消化组织块25 min，期间反复振摇两次，以血清中止消化，之后反复吹打使之成为单细胞悬液，1 000×g离心10 min，弃去上清，D-hank's洗两次，过200目的尼龙滤网，收集悬液1 000×g离心10 min，弃去上清，用添加了10%胎牛血清和青霉素1×105U·L－1、链霉素1×105U·L－1的DMEM/F12培养液重悬细胞，接种至4 个75 cm2培养瓶中，15 ml/瓶，37 ℃、5%CO2培养箱中静置培养，3 d后换液去除死亡的细胞碎片，10 d左右混合胶质细胞铺满瓶底时，旋紧瓶盖，石蜡膜封口，于37℃的恒温摇床中以200 r·min－1的速度振摇约12 h，收集细胞悬液，置于新培养瓶(板)中继续培养4 h，轻轻振摇培养瓶5 min，弃上清，所剩为小胶质细胞，换上新鲜含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液。

1.3小胶质细胞鉴定将小胶质细胞接种到覆盖玻片的培养孔内，待细胞贴壁后，取出细胞，PBS冲洗，4%聚甲醛固定，一抗用CD11b(1∶100)，二抗为羊抗兔IG-FITC(1∶100)，0.01%的DAPI复染细胞核，1∶9甘油缓冲液封闭，荧光显微镜下观察。

1.4缺氧/复氧模型的制备和实验分组取生长状态良好的小胶质细胞，调整细胞浓度为1×109·L－1，接种到24孔培养板内，每孔1 ml，待细胞生长至80%汇合状态后，用PBS清洗两次，更换培养液无糖DMEM培养液。缺氧在厌氧培养盒进行，将培养板放入缺氧盒内，向盒内通入含95%N2和5%CO2的混合气体，20 min(流量 1.5 L·min－1)，夹闭盒的出口与入口，37℃培养4 h，换成正常培养液继续培养12 h即为缺氧/复氧模型。实验分组:①对照组:用正常培养液培养;② 模型组:缺氧4 h，复氧12 h;③栀子苷低剂量组、中剂量组、高剂量组分别在缺氧时加入用无糖DMEM配制的终浓度分别为 125 μmol·L－1(低剂量组)、250 μmol·L－1(中剂量组)和 500 μmol·L－1(高剂量组)栀子苷，在复氧时加入由正常培养液配制的相应浓度的药物。栀子苷药物浓度的选定是根据前期MTT的实验结果，在 125 μmol·L－1栀子苷对正常和缺氧/复氧小胶质细胞的活性没有影响，250 和 500 μmol·L－1栀子苷能够不同程度地促进正常和缺氧/复氧小胶质细胞的增殖。

1.5逆转录聚合酶链反应检测小胶质细胞TLR4 mRNA的表达用TRIzol法提取细胞总RNA，紫外分光光度计测定A260/A280为1.8～2.0，证实RNA纯度符合RT-PCR反应要求。以总RNA为模板，用Oligo-d(T)18为引物逆转录合成第一链cDNA，特异性引物分别扩增TLR4和β-actin。TLR4引物序列为上游5'-GCACTGTTCTTCTCCTGCC-3'，下游5'-GTTTCCTGTCAGTATCAAG-3'(250 bp)。β-actin引物序列:上游 5'-TGTGCTATGTTGCCCTAGACT-3'，下游 5'-TCGTACTCCTGCTTGCTGAT-3'(442 bp)。PCR条件为94℃预变性5 min，95℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃ 延伸 30 s，TLR4 循环 35 次，β-actin循环30次，最后72℃延伸7 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳PCR产物。实验重复3次，用Qautity One软件分析TLR4与β-actin的PCR产物灰度值，以二者比值来表示TLR4 mRNA的相对表达量。

1.6Western blot检测TLR4、p-IκBα、p38、p-ERK1/2蛋白将缺氧/复氧和LPS刺激后的小胶质细胞以冰冷的PBS终止，洗两次，提取细胞总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取50 μg样品煮沸变性后进行SDS-PAGE电泳(5%的浓缩胶和10%的分离胶)，转膜，5%的脱脂奶粉37℃封闭1 h，加抗体TLR4、p-IκB、p38、p-ERK1/2，阳性对照用 β-actin 单克隆抗体，4℃孵育过夜，洗膜，加辣根过氧化物酶标记的相应二抗稀释液(1∶3 000)37℃孵育1 h，ECL法显影，分析条带灰度值。实验重复3次，以目的条带与β-actin条带的灰度比值来表示蛋白相对表达量。

1.7MyD88和NF-κB免疫荧光双染将小胶质细胞接种到覆盖玻片的培养孔内，贴壁生长48 h后，进行缺氧/复氧和栀子苷干预后，取出细胞，PBS冲洗，4%多聚甲醛固定，一抗分别为MyD88(小鼠抗大鼠)和 NF-κBp65(兔抗大鼠)，抗体浓度为1∶200;二抗为羊抗小鼠 IG-TexRed和羊抗兔 IGFITC(1∶200)，0.01%的DAPI复染细胞核，1∶9甘油缓冲液封闭，荧光显微镜下观察。

2 结果

2.1小胶质细胞形态学观察和鉴定培养3 d时首次换液倒置显微镜下观察分离出的细胞呈团状聚集，均匀铺于瓶底;6 d后可见大量的星形胶质细胞从细胞团中爬出伸展，铺于星形胶质细胞之上的胞体较小而发亮、折光性强、突起短小弯曲而密集、形如蜘蛛腿的则是小胶质细胞，另外有少数圆形或者椭圆形的小胶质细胞呈一定程度活化状态;10 d后小胶质细胞基本汇合，此时可以振摇纯化小胶质细胞。纯化后的小胶质细胞牢牢地贴附于瓶底生长，大部分小胶质细胞胞体较小，折光性强而发亮，突起短小弯曲，形似蜘蛛腿，少数可见细长突起;还有一部分小胶质细胞呈圆形、扁圆形、或棒状，这样的小胶质细胞显示出一定程度的活化状态。

Tab 1 Effect of geniposide on the hypoxia/reoxygenation induced microglia(±s，n=3)

Tab 1 Effect of geniposide on the hypoxia/reoxygenation induced microglia(±s，n=3)

*P＜0.01 vs model

Group Control Model Geniposide/μmol·L －1 125 μmol·L －1 250 μmol·L －1 500 μmol·L －1 TLR4 0.3019 ±0.012* 0.4527 ±0.028 0.4319 ±0.022 0.4401 ±0.035 0.2857 ±0.016*p-ERK1/2 0.2964 ±0.035* 0.5361 ±0.051 0.5085 ±0.043 0.2894 ±0.015* 0.3018 ±0.016*p-IκB 0.3545 ±0.041* 0.4908 ±0.042 0.3853 ±0.031 0.3038 ±0.037* 0.3116 ±0.024*p38 0.2737 ±0.016* 0.4426 ±0.039 0.4318 ±0.033 0.3179 ±0.028* 0.2824 ±0.019*

小胶质细胞的鉴定用CD11b抗体，细胞膜上有明显的绿色荧光染色，胞核空泡样，符合细胞膜分布的特点，证实为小胶质细胞。

2.2 TLR4mRNA的PCR结果TLR4mRNA的表达(Fig 1，2)和TLR4蛋白的表达(Tab 1)在趋势上基本一致，对照组和高剂组与模型组比差异有显著性，低剂量组和中剂量组差异无显著性。缺氧/复氧激活了TLR4受体，栀子苷高剂组通过对TLR4受体的抑制发挥抗炎作用。

2.3TLR4、p-ERK1/2、p-IκB、p38的Western blot结果p-ERK1/2、p-IκB和 p38蛋白的表达对照组在栀子苷中剂组和高剂组与模型组比较差异均有显著性(P＜0.01)。说明栀子苷中剂组和高剂组是通过抑制ERK1/2、IκB和p38蛋白磷酸化激活而发挥作用的。

Fig 1 The expression of TLR4Mrna in microglia

Fig 2The expression of TLR4mRNA in microglia(±s，n=3)*P＜0.05 vs model

Fig 3 The expression of TLR4，p-ERK1/2，p-IκB、p38

2.4MyD88和NF-κB的免疫荧光双染结果NF-κB p65的核移位是NF-κB活化的标志，也是有关NF-κB生理病理变化的开始。从Fig 4中可以看出模型组和栀子苷低剂组的NF-κB p65在细胞核表达较高，对照组、栀子苷中剂组和高剂组与模型组比较主要表达在胞质中，细胞核中较少。说明缺氧/复氧促使NF-κB p65磷酸化并进入核中，启动转录活性。MyD88主要表达在胞质中，模型组和栀子苷低剂组表达较高，对照组、栀子苷中剂组和高剂组与模型组比较较少，表达趋势与NF-κB p65核转位趋势一致。

3 讨论

Toll样受体(toll-like receptors，TLRs)是天然免疫受体家族，目前发现的TLR家族蛋白有13种，其中Toll样受体4(toll-likereceptor4，TLR4)是研究较为深入的受体，已证实TLRs在星形胶质细胞和小胶质细胞均有表达，且其表达程度受到缺氧、炎症因子等一系列内源性或外源性因素刺激的调节［2］，提示TLRs在中枢神经系统炎症免疫反应中起着重要的调控作用。TLR4受体在脑缺血/再灌注过程中被激活［3］，在缺血/缺氧状态下，脑组织中的一些内源性介质可以作为配体激活TLR4受体，例如热休克蛋白(heat-shock proteins，HSP)，其中HSP70可以通过CD-14依赖方式激活TLR4受体来传导促炎症反应信号，经MyD88信号传导途径来诱导促炎症反应细胞因子的分泌［4］。MyD88的启动使其下游的I-κB迅速磷酸化激活，与NF-κB解离，NF-κB进入细胞核，与p38、ERK1/2磷酸化后激活的激活蛋白1(AP-1)共同作用促使细胞因子TNF-α、IL-6和IL-8等的分泌，形成组织周围的炎性反应。本实验通过对原代培养的小胶质细胞的缺氧/复氧实验也证实缺氧/复氧激活了TLR4通路，模型组TLR4mRNA和蛋白较对照组均表达上调，通路下游 MyD88、p-IκB、p38 和 p-ERK1/2 磷酸化蛋白表达增多，NF-κBp65入核率增加，提示缺氧/复氧使小胶质细胞活化，通过MyD88的依赖TLR4通路发挥免疫作用。

Fig 4 The immunofluorescence double staining of MyD88 and NF-κBp65(×100)

栀子是药食两用传统中药，药用栀子是茜草科植物栀子的干燥成熟果实，性寒味苦，归心、肺、三焦经，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒之功效。栀子苷是从栀子中提取的环烯醚萜苷类化合物。国内外研究显示，栀子苷具有抗炎［5］、抗肿瘤、镇痛、降压、保肝利胆、抑制胃液分泌和降低胰淀粉酶、保护缺血性脑神经损伤等作用［6］。在对小胶质细胞进行缺氧/复氧时，我们加入了终浓度分别为125、250和 500 μmol·L－1栀子苷，发现对于 TLR4mRNA 和TLR4蛋白只有 500 μmol·L－1与模型组比较差异有显著性，而对于 MyD88、p-IκB 、NF-κB、p-ERK1/2和 p38 蛋白，栀子苷250 和500 μmol·L－1均表现出了抑制作用。其机制可能是缺氧/复氧使小胶质细胞内一些内源性配体活化，在激活TLR4通路的同时也激活了TLRs的其他通路，如TLR2或TLR6等，这些通路也可依赖MyD88途径激活下游蛋白(我们后期的实验也证明了这一点，缺氧/复氧后TLR2和TLR6的mRNA和蛋白的表达增加)。因此，栀子苷抑制了缺氧/复氧引起的TLR4mRNA和通路蛋白的表达，进而抑制了一系列瀑布式级联反应发挥抗炎效应。但通路之间的交叉串流使栀子苷治疗脑缺血的机制更加复杂，有待于我们进一步实验证实。

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