吲哚-3-原醇对复合因素所致肝纤维化大鼠的治疗作用及部分机制研究

高爱梅，平 洁，2，汪 晖，2

(武汉大学1.基础医学院药理学系、2.食品与药品评价研究中心，湖北 武汉 430071)

肝纤维化是各种致病因素引起肝脏慢性炎症、坏死、纤维组织持续增生的病理过程，其发病与细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的合成和降解失衡，在肝脏内过度沉积有关。肝纤维化是肝硬化的早期病理改变和必经阶段，其发生、发展是影响诸多肝病预后和转归的关键。吲哚-3-原醇(indol-3-carbinol，I3C)是葡萄糖蔓芹苷的前体，大量存在于十字花科类食用蔬菜如西兰花等。研究发现，I3C有抑制肿瘤细胞增殖和诱导癌细胞凋亡、清除氧自由基和抗脂质过氧化等作用［1－2］，常用来治疗胸部、消化道、肝脏和前列腺等处的肿瘤［3－4］。有研究报道［5－6］，I3C对二甲基亚硝胺、四氯化碳诱导的急性肝损伤有保护作用。本室前期分别在肝切片和细胞水平，证实I3C对肝细胞有保护作用，且能抑制ECM的主要来源细胞—肝星状细胞(hepatic stellate cells，HSC)的增殖［7－8］。然而，其对整体动物肝纤维化是否有保护作用，目前国内外尚未见报道。本研究在整体水平观察I3C对复合因素所致大鼠肝纤维化的治疗作用，并初步探讨其机制。

1 材料与方法

1.1试剂与药品I3C，美国Sigma公司;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒、丙二醛(malondialdehyde，MDA)检测试剂盒、羟脯氨酸(hydroxyproline，Hyp)检测试剂盒，南京建成生物工程研究所;α-平滑肌肌动蛋白多克隆抗体(αsmooth muscle actin，α-SMA)免疫组化 SP法试剂盒，北京中杉金桥生物技术有限公司;碱性磷酸酶、Western blot显色剂购自Hyclone公司。基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinase-2，MMP-2)多克隆抗体购自Santa Cruz公司。GAPDH单克隆抗体购自上海康成生物技术有限公司。

1.2实验动物♂Wistar大鼠，体质量200～220 g，由湖北省疾病预防中心提供，SPF级，许可证号:SCXK(鄂)2006-2008。

1.3实验方法48只♂Wistar大鼠，随机分成6组，每组8只:正常对照组、I3C对照组、模型对照组、I3C小剂量组、I3C中剂量组、I3C大剂量组。适应性饲养1周后，除正常对照组和I3C对照组外，所有动物给予高脂低蛋白饲料(89.5%玉米粉，0.5%胆固醇，10%猪油)，并饮用5% ～10%乙醇溶液(前3天5%乙醇，以后10%乙醇)。1周后首次皮下注射 40%CCl4橄榄油 5 ml·kg－1，以后每周两次(周一、周四)注射3 ml·kg－1，连续3周。造模结束后，I3C小、中、大剂量组及I3C对照组分别腹腔注射I3C 3、6、12 和12 mg·kg－1，正常及模型对照组皮下注射等容量橄榄油(1 ml·kg－1)。连续给药10 d后，断头处死动物，取血 3 ～5 ml，3 500 r·min－1离心10 min，制备血清，－20℃冻存;于肝右叶取肝组织，一部分用4%多聚甲醛固定24 h，石蜡包埋，4～7 μm厚连续切片做病检，余下的肝组织－80℃冻存。

1.4检测指标

1.4.1大鼠一般情况及生化指标的检测包括大鼠的精神状态、活动、皮毛光泽、食量及粪便等以及肝脏的外观、颜色和质地。按试剂盒说明比色法，测定肝组织Hyp、SOD和MDA的水平。

1.4.2病理学检测部分肝组织以4%多聚甲醛固定后，石蜡包埋，切片，作HE染色及Masson三色染色，观察肝脏病理学改变及胶原含量。免疫组化SP法检测肝脏α-SMA的表达。切片常规脱蜡至水，0.01 mol·L－1柠檬酸盐缓冲液微波修复5 min，加入3%H2O2室温下孵育15 min，正常兔血清37℃封闭15 min;加一抗α-SMA多克隆抗体(1∶200)，37℃孵育2 h;滴加生物素化二抗，37℃孵育20 min;滴加三抗，37℃孵育20 min;DAB显色，苏木精复染核，逐级脱水，透明，封片。胞质染成棕黄色为阳性细胞。在显微镜下每张玻片选取5个10×40倍视野，输入HMIAS-2000高清晰彩色图文分析仪(武汉千屏影像技术公司)，检测阳性细胞区域面积。

1.4.3Western blot分析肝匀浆中MMP-2的表达

肝脏用组织裂解液匀浆后，BCA法测蛋白，取适量的蛋白样本进行SDS聚丙稀酰胺凝胶电泳，将凝胶中的蛋白转移到硝酸纤维素(NC)膜上，用封闭液封闭1 h;加入1∶100稀释的MMP-2一抗，室温孵育2 h;取出NC膜洗涤后，再与辣根过氧化物酶标记的相应二抗孵育1 h;洗涤后加底物，显色，终止吸干。

1.5统计学处理实验数据均以±s表示，组间比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)。数据采用SPSS 11.0软件进行分析。图表制作以Prism 5.0软件操作。

2 结果

2.1大鼠一般情况整个实验过程中，无大鼠死亡。正常对照组及I3C对照组大鼠毛顺有光泽，活泼好动，食量及大便正常;模型对照组大鼠皮毛疏松无光泽，精神萎靡，懒动，饮食减少，大便干燥松散不成形;I3C治疗组一般状态较模型对照组有所减轻。

2.2肝脏组织病理学

2.2.1肝脏外观正常对照组和I3C对照组大鼠肝脏被膜光滑，呈红褐色，质地中等;模型对照组大鼠肝脏偏黄白色，油腻，无光泽，质地偏硬，部分表面轻度桔皮样变。经I3C治疗后，大鼠肝脏桔皮样变减轻，肝脏色泽、质地有不同程度改善。

2.2.2肝切片HE染色正常对照组(Fig 1A)及I3C对照组(Fig 1D)大鼠肝小叶结构完整，肝索整齐，肝窦正常，无炎性细胞浸润及纤维组织增生;模型对照组(Fig 1B)大鼠肝索紊乱，炎细胞浸润和组织坏死明显，弥漫的脂肪变性，纤维组织大量增生，形成粗细不一的纤维间隔并向小叶内延伸;各给药组(Fig 1C)炎细胞浸润，组织坏死减轻，部分肝小叶结构恢复，肝索排列较规则，纤维间隔缩短变窄，纤维化分期下降。

2.3肝脏胶原改变

2.3.1肝切片Masson染色正常对照组(Fig 2A)和I3C对照组(Fig 2D)仅有少量胶原表达于中央静脉壁及汇管区;模型对照组(Fig 2B)可见胶原纤维大量沉积于汇管区，并沿汇管区向外延伸，形成厚薄不一的纤维间隔，分割包绕肝小叶，局部有假小叶形成;与模型对照组相比，I3C给药组(Fig 2C)肝小叶结构基本恢复正常，肝索排列较整齐，胶原沉积明显减少，纤维间隔变薄。Masson图像分析(Fig 3)也证实，I3C能明显降低大鼠肝组织胶原纤维的含量(P＜0.05)。

Fig 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on liver histopathology(HE staining)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 2 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on liver collagen secretion(Masson’s trichrome staining)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 3 Effects of 3，6 and 12 mg·kg-1indole-3-carbinol(I3C)on liver collagen percentage in multiple hepatotoxic factors-induced rat liver fibrosis by semiquantitative analysis using Medical Color Image Analysis System(±s，n=4)

2.3.2肝脏Hyp含量的变化与正常对照组相比，模型对照组Hyp含量明显升高(P＜0.01);I3C各治疗组可改善肝纤维化程度，降低肝组织Hyp含量(Tab 1)。

Tab 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on hydroxyproline(Hyp)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(±s，n=8)

Tab 1 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on hydroxyproline(Hyp)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs normal control.

Group Dose/mg·kg－1 Hyp/mg·g －1 Normal control － 125±16 Fibrotic control － 352±96＊＊Fibrotic+I3C 3 303±95 Fibrotic+I3C 6 259±131 Fibrotic+I3C 12 316±75 I3C control 12 166±23

2.4肝切片α-SMA免疫组化正常对照组(Fig 4A)和I3C对照组(Fig 4D)仅见α-SMA在血管壁及肝血窦Disse间隙内少量表达，模型对照组(Fig 4B)α-SMA表达明显，主要分布于窦周、胶原沉积处、纤维间隔处，I3C治疗组(Fig 4C)α-SMA在表达范围、强度上都减轻，且表现为一定的量效关系(Fig 5)。

Fig 4 Effects of indole-3-carbinol(I3C)on expressions of α-smooth muscle actin(α-SMA)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats(200×)

Fig 5 Effects of 3，6 and 12 mg·kg-1indole-3-carbinol(I3C)on expressions of α-smooth muscle actin(a-SMA)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats by semiquantitative analysis using Medical Color Image Analysis System(±s，n=3)

2.5肝匀浆MMP-2的Western blot分析Western blot检测发现，72 ku处显示清晰的条带为MMP-2(Fig 6)，与正常组比较，模型对照组MMP-2降低，与模型对照组比较，给药组MMP-2升高，尤以I3C大剂量组明显。

Fig 6 Western blot analysis of matrix metalloproteinases-2(MMP-2)of indole-3-carbinol(I3C)in multiple hepatotoxic factors-induced liver fibrosis of rats

2.6肝组织抗氧化指标与正常对照组比，模型对照组MDA含量明显升高，SOD活性明显降低(P＜0.01);与模型对照组比，I3C治疗组可升高SOD活性，尤以大剂量组明显(P＜0.01)。见Tab 2。

3 讨论

慢性肝损伤模型主要有CCl4、白蛋白、乙醇和复合因素慢性肝损伤模型。复合因素中的3种因素(CCl4、乙醇、高脂低蛋白饲料)均能损伤肝细胞，长期给予CCl4、乙醇、高脂低蛋白饲料后，损伤的肝脏可进一步发生纤维化，较单因素模型具普遍性和现实意义，能更准确模拟自然生活环境，适用于抗肝纤维化的药物作用研究。本实验中，复合因素处理大鼠4周后即可见肝细胞脂肪变性明显，肝脏门管区纤维组织增生，部分伸入肝小叶，同时肝指数和肝脏Hyp含量明显升高，说明本实验中肝纤维化模型的复制是成功的。

Tab 2 Effect of indole-3-carbinol(I3C)on liver homogenate SOD and MDA in rats(±s，n=8)

Tab 2 Effect of indole-3-carbinol(I3C)on liver homogenate SOD and MDA in rats(±s，n=8)

＊＊P ＜0.01 vs normal control;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs fibrotic control.

Group Dose/mg·kg－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/kU·g－1Pro Normal control － 3.3 ±0.9 146±16 Fibrotic control － 5.4 ±1.7＊＊ 124±13＊＊Fibrotic+I3C 3 4.8 ±2.0 133 ±11 Fibrotic+I3C 6 7.7 ±2.2 155 ±42#Fibrotic+I3C 12 11.2 ±5.4 193 ±17##I3C control 12 4.3 ±1.2 120 ±40

有报道，I3C对二甲亚硝胺、CCl4所致的急性肝损伤有保护作用［5－6］，那么 I3C对慢性肝损伤是否同样具有保护作用呢?本研究利用复合因素所致大鼠肝纤维化模型，观察了I3C对肝纤维化的治疗作用。HE染色结果显示，I3C能够部分改善肝细胞的变性和坏死程度，促进肝纤维化的逆转。

已知自由基的大量生成和脂质过氧化反应加重是CCl4致肝细胞毒性的主要细胞机制，而且在CCl4致大鼠肝纤维化模型中发现，脂质过氧化反应与纤维生成呈明显正相关［9］。此外，乙醇的代谢产物，如乙醛，能够直接诱导HSC活化和胶原纤维的生成［10］。在本研究中，我们通过检测肝组织中 MDA含量和SOD活性，证实了复合因素所致肝纤维化形成过程中脂质过氧化反应加重。肝纤维化大鼠经I3C治疗后，小剂量组MDA含量有所降低，SOD活性则明显增加，且呈一定的量效关系，提示I3C对肝细胞具有一定的保护作用，使其抗氧化能力增强。

HSC的激活是肝纤维化形成的关键，本研究观察了 HSC 活化的特异性标志物——α-SMA［11］。首先，利用免疫组织化学技术观察了α-SMA在肝组织中的定位表达情况，研究结果显示，I3C给药组α-SMA的阳性表达比模型对照组明显减少，半定量分析结果亦显示出显著性差异，且呈现良好的剂量依赖性，说明I3C可减少活化HSC的数量，阻断肝纤维化形成的始动阶段。

此外，胶原作为一种ECM，是纤维化肝脏的主要成分之一［11］。活化的HSC合成大量胶原，使肝脏的胶原合成与降解失衡，而Hyp被认为是胶原的主要成分，因此本研究通过测定肝组织Hyp的含量来间接反映HSC激活和肝内胶原情况。结果显示，模型对照组大鼠肝组织Hyp含量较正常对照组明显增加，而各给药组Hyp含量则有不同程度的下降，这与Masson三色染色所观察到的肝脏胶原含量的半定量分析结果一致。肝纤维化是ECM合成大于降解，在肝脏内过度沉积所致。ECM的合成和降解过程主要由基质金属蛋白酶组织抑制剂(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)/MMPs这对平衡剂来调节。MMPs可降解ECM，亦可以被内源性抑制因子 TIMPs 所抑制［12－13］。文献报道［14］，肝纤维化恢复期，由于HSC的凋亡，TIMPs表达减少，其对MMPs的抑制作用也减弱，MMPs活性增强，胶原降解增加，肝纤维化逆转。本研究检测肝匀浆MMP-2蛋白的表达，发现I3C能促进MMP-2表达。以上结果说明I3C能够增强MMPs活性，促进ECM降解，降低肝脏胶原沉积，促进肝纤维化的逆转。

目前I3C在临床上主要用于肿瘤的辅助治疗。临床和动物实验均已证实，I3C毒副作用小，安全范围较宽。本研究发现，I3C对照组与正常对照组在病理检查和生化指标上几无差别，说明I3C在本研究受试浓度下较为安全。

综上所述，本研究发现I3C能有效的治疗复合因素所致的大鼠肝纤维化，其机制与其增强MMPs活性，促进ECM降解，并抗氧化有关。

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