环孢素A混合胶束的制备与理化性质考察

潘 昊 ，李 翔 ，张 婧 ，王东凯

(1.沈阳药科大学药学院，辽宁 沈阳 110016;2.江西中医学院现代中药制剂教育部重点实验室，江西 南昌 330004)

环孢素A(cyclosporin A)是含11个氨基酸的环状多肽类药物，为目前临床普遍应用的强效免疫抑制剂之一，临床效果良好[1]。环孢素A亲脂性强、生物利用度低，具有不可逆肾毒性[2]。胶束作为药物载体具有提高药物溶解度[3]和安全性、降低毒副作用、增强药物疗效等优点，是国内外新剂型研究的热点之一。胆固醇硫酸酯钠为胆固醇分子衍生后形成的具有亲水性基团的两性分子，具有无毒、无刺激性特点，结构上与胆盐存在着一定的相似性，在水中可通过亲脂性部分的疏水力或亲水性部分的极性亲和力与药物分子作用形成胶束。与胆盐磷脂混合胶束系统相比，胆固醇硫酸酯钠/磷脂胶束制备工艺简单、制剂成本低廉、稳定性更强，并且各成分均具有生物相容性。通过与磷脂的亲水头部和两个疏水的尾部产生交连作用，可增加难溶性药物的载药量。因此，笔者以多肽药物环孢素A为模型药物、胆固醇硫酸酯钠/磷脂为脂质材料，制备了环孢素A混合胶束并考察了其理化性质。现报道如下。

1 仪器与试药

LC-10A型高效液相色谱仪(日本岛津株式会社)，包括SPD-10A紫外检测器、Anstar色谱工作站;LS 230型粒径分析仪(美国Beckman公司);Delsa 440 SX型电位测定仪(美国Beckman公司);JM-1200 EX型透射电子显微镜(日本Jeol公司);8010型搅拌式超滤装置(美国Millipore公司);RE-52AA型旋转蒸发仪(上海青浦沪西仪器厂);85-2型恒温磁力搅拌仪(上海司乐仪器厂);ZRD6-B型溶出仪(上海黄海药检仪器厂)。环孢素A(福建科瑞药业有限公司，批号为050402);大豆磷脂(Lipoid公司，纯度大于95%);胆固醇酰硫酸酯钠(自制，纯度大于90%);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 制备

取处方量的胆固醇硫酸酯钠、磷脂和环孢素A，用甲醇溶解，经旋转蒸发除去有机溶剂，在圆底烧瓶底部形成透明薄膜，真空放置过夜后加水合介质，旋转洗脱，静置2.5 h，洗脱液用0.22 μm微孔滤膜除去不溶物，得环孢素A混合胶束。

表1 环孢素A混合胶束处方筛选的因素水平表

表2 环孢素A混合胶束处方筛选的正交试验结果

经预试验后，以包封率为评价指标，环孢素A与磷脂的质量比(因素A)、胆固醇硫酸酯钠与磷脂的质量比(因素B)以及水合介质种类(因素C)为影响因素，采用L9(34)正交设计表筛选处方。正交设计的因素水平见表1，正交试验结果见表2。由表2中极差值(Rj)可知，各因素对胶束包封率的影响程度大小依次为B＞A＞C，最优处方为A3B1C2，即环孢素A与磷脂的质量比为1∶7，胆固醇硫酸酯钠与磷脂的质量比为1∶4，水合介质为双蒸水。

2.2 含量与包封率测定

2.2.1 色谱条件

色谱柱:DiamonsilTMC18柱(300 mm ×4.6 mm，10 μm);流动相:乙腈-甲醇-水(40∶35∶25);检测波长:210 nm;流速:1.0 mL/min;柱温:70 ℃;进样量:20 μL。

2.2.2 方法学考察

称取环孢素A对照品适量，定量转移至容量瓶中，以甲醇定容，摇匀，作为标准贮备液。移取标准贮备液适量，用甲醇稀释成1.0，5.0，10.0，25.0，50.0，100.0 μg/mL 的环孢素 A 溶液，进样测定峰面积。以样品色谱峰峰面积(A)对环孢素A质量浓度(C)进行线性回归，得标准曲线方程 A=1.3×105C+1.0×105，r=0.999 7(n=6)。结果表明，环孢素A质量浓度在1.00～100.0 μg/mL范围内与峰面积线性关系良好。该法的专属性、精密度及回收率均符合方法学要求。

2.2.3 样品处理

取胶束溶液适量，用甲醇溶解，得透明澄清溶液，稀释至适宜质量浓度后，用高效液相色谱法测定其环孢素A的质量浓度。

2.2.4 环孢素A含量与包封率测定

采用超滤法测定环孢素A混合胶束的包封率。取适量环孢素A混合胶束，置超滤器内，在磁力搅拌器上用超滤膜氮气加压超滤，收集续滤液。取续滤液适量，稀释至适当质量浓度，测定药物含量 Wfree。另取适量环孢素A混合胶束，按2.2.3项下方法处理，测定药物含量 Wtotal。根据公式计算包封率(EE):EE=Wtotal-Wfree/Wtotal×100%。3批环孢素A混合胶束的环孢素A含量与包封率测定结果见表3。

表3 环孢素A混合胶束中环孢素A含量与包封率测定结果

2.3 理化性质考察

2.3.1 形态

采用负染色法处理样品。在载有Formvar支持膜的铜网上滴环孢素A混合胶束，自然晾干后滴加0.3%磷钨酸，用滤纸吸走多余液体，放置10 min，于透射电子显微镜下观察胶束形态。结果见图1。

图1 透射电镜图(×30000)

2.3.2 粒径

取3批环孢素A混合胶束，稀释适当倍数后测定其粒径及其粒度分布。3批样品的粒径均呈单峰分布，粒度范围为85～205 nm，粒径分布图见图2，粒径测定结果见表4。

图2 粒径分布图

表4 环孢素A混合胶束的粒径和Zeta电位

2.3.3 Zeta电位

取3批环孢素A混合胶束，稀释适当倍数后测定其Zeta电位。3批样品的Zeta电位均为负(表4)。

2.4 体外释放试验

取环孢素A混合胶束适量，置处理过的透析袋中，两端夹紧后固定于搅拌桨上，放入0.15%的胆固醇硫酸酯钠磷酸盐缓冲液(pH=6.8)中，测定药物累积释放百分比。将搅拌转速调为50 r/min，搅拌温度为(37 ±0.5)℃，分别于 0.25，0.5，1，2，4，6，8，12，24 h 时取出透析介质1.0 mL，同时补入等温空白释放介质1.0 mL。样品液用0.45 μm微孔滤膜过滤，按2.2.3项下方法处理样品，记录保留时间和峰面积，计算药物的累积释放百分比。由图3可见，药物释放初期有突释现象，此后环孢素A从混合胶束中释放得比较缓慢，最初6 h释放了药量的(28.4±1.1)%，随后药物几乎以恒定速率释放，24 h内释放药物总量的(33.1±2.7)%。

图3 累积释放曲线

3 讨论

环孢素A在水性介质中的溶解度极小，为满足体外释放所需的漏槽条件[4]，选择5%葡萄糖注射液、0.1%胆固醇硫酸酯钠磷酸盐缓冲液、0.15%胆固醇硫酸酯钠磷酸盐缓冲液、0.3%胆固醇硫酸酯钠磷酸盐缓冲液以及0.3%吐温-80溶液作为释放介质，测定相应的药物溶解度。结果表明，0.15%胆固醇硫酸酯钠磷酸盐缓冲液可满足漏槽条件，因此被选为释放介质。

环孢素A是一种难溶性的环状多肽，胆固醇硫酸酯钠胶团由于体积较小而对环孢素A的增溶能力有限。然而在胆固醇硫酸酯钠/磷脂混合胶束中，磷脂的存在增大了胶束的体积以及胶束对药物的亲和力，从而大大提高了对难溶多肽药物的增溶能力。体外释放测定结果表明，一部分药物分子可能分散在胶束的表面，因此在释放初期产生药物突释现象;之后药物需要通过内部的孔道扩散进入释放介质，因此后期药物几乎以恒定速率释放。

[1]黄玉凤，王 慧，张国庆.环孢素在自身免疫性疾病中的临床应用进展[J].药学实践杂志，2006，24(4):23-28.

[2]任吉忠，闵志廉，朱有华.环孢素软胶囊在肾移植病人中的应用[J].中国新药与临床杂志，2000，19(5):398-400.

[3]Hammad MA，Müller BW.Solubility and stability of lorazepam in bile salt/soya phosphatidylcholine-mixed micelles[J].Drug Dev Ind Pharm，1999，25(4):409-417.

[4]Saarinen-Savolainen P，Järvinen T，Taipale H，et al.Method for evaluating drug release from liposomes in sink conditions[J].Int J Pharm，1997，159(1):27-33.