ES探针荧光原位杂交法检测bcr/abl融合基因

叶爱芳 陈迟琪 胡晓霞 尹丽慧 吴建波

(温州医学院附属第一医院,浙江 温州 325000)

慢性髓细胞性白血病(chronic myelogenous leukemia,CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性疾病,其主要的遗传学异常是Ph1染色体形成,产生bcr/abl融合基因,导致白血病细胞的克隆性增生。目前,检测CML遗传学和分子生物学异常的主要方法有染色体核型分析和PCR技术。而荧光原位杂交技术(fluorecence in situ hybridization,FISH)以其快速、简便、准确的特点,正逐步应用于各种血液病的检测,特别是在CML的诊断和随访中发挥了重要的作用,是遗传学和分子生物学的桥梁。现对30例(骨髓标本43份)CML初诊或复诊患者,行普通染色体核型分析和ES型bcr/abl探针FISH分析,探讨ES型bcr/abl探针荧光原位杂交技术在检测bcr/abl融合基因中的价值。

1 材料与方法

1.1 材料 选择2009年7月～2010年7月本院行bcr/abl融合基因检测的骨髓标本43份,涉及患者30例,包括CML初诊患者和CML行格列卫治疗不同阶段的患者。男18例,女12例,年龄16～77岁。慢性髓细胞性白血病的诊断标准参照张之南[1]的《血液病诊断及疗效标准》。同时设阴性对照5例,为非慢性髓细胞性的白血病患者。

1.2 方法

1.2.1 细胞染色体培养 染色体培养采用含10%胎牛血清(FBS)、10ng/mL粒细胞集落刺激因子(GCSF)的1640培养液置37℃、5%CO2环境中培养 24小时后,按常规方法收获染色体,气干法滴片,G显带,并根据国际标准核型模式图(ISCN 1995)进行核型分析。其余标本置冰乙酸:甲醇(1:3)的固定液中,保存于-20℃冰箱中备用。

1.2.2 bcr/abl双色单融合基因探针 选用北京金菩嘉的双色单融合ES型DNA探针。其中bcr探针为位点特异性探针,杂交于22号染色体22q11.2,覆盖主要断裂点以上的部分bcr基因,荧光信号为绿色;abl杂交信号位于9号染色体9q34,覆盖整个abl基因及ass基因,荧光信号为红色。探针模式如第236页图1。

1.2.3 FISH流程 制好的玻片在37℃新鲜配制的 RNase A(100μ g/mL)溶液中孵育 60分钟。室温下于2×SSC(pH 7.0)溶液中漂洗玻片2次,每次5分钟。将玻片依次置于-20℃预冷的70%、85%和100%乙醇中各3分钟脱水;自然干燥玻片。玻片加热至56℃。室温下,将7μ L杂交缓冲液、2μ L探针和1μ L去离子水混合加入小的EP管中,充分混匀。把探针混合物加到玻片的目标区域处,盖上18mm×18mm的盖玻片,封片胶封片。把玻片放到杂交仪上热变性,变性条件为78℃×5分钟,后在42℃,一定的湿度下杂交过夜。移去盖玻片,立即将玻片放入46℃预热的2×SSC溶液中,轻微晃动玻片,漂洗15分钟,然后在2×SSC/0.1%NP-40洗液晃动5分钟,后75%乙醇脱水3分钟,自然干燥玻片。玻片干燥后,将10μ L DAPI复染剂加于杂交区域位置,立即盖上盖玻片。暗处放置10～20分钟后,在荧光显微镜下Olympus BX-51选用合适的滤光片组观察玻片。

1.2.4 FISH结果判断 正常人骨髓中间期细胞显示两红(2R)两绿(2G)荧光信号,分别位于正常的9号和22号染色体上。如果bcr/abl融合基因为主要断裂融合方式,则表现为红-绿-黄-小红;但是如果患者伴有ass基因的缺失,ass缺失会带走abl的一部分基因,那么小红信号就会丢失,表现为红-绿-黄。如果bcr/abl融合基因为次要断裂融合方式,则表现为红-绿-黄-黄。

2 结 果

2.1 常规遗传学结果 43份CML初诊或复查患者的骨髓标本,6份未做骨髓培养,其他培养成功31例,核型分析找到Ph1染色体9例,其中6例CML初诊患者都有Ph1染色体,另有1例CML复查患者多次检查都发现21p+染色体异常;6例培养失败,没找到中期分裂相。

2.2 FISH结果

2.2.1 阈值的建立 5例非慢性髓细胞性白血病标本,每份计数200个间期细胞,正常间期细胞显示为2红2绿(第236页图2,Fig.1),带有融合信号的细胞显示为黄色荧光信号(第236页图2,Fig.2或Fig.3),其值为(3.10 ±1.82)%,带有(¯x+3s)判定为bcr/abl融合基因阳性,本组即融合信号＞8.56%为bcr/abl融合基因阳性。

2.2.2 结果 在涉及的30例中,有6例是初诊患者,其染色体结果和FISH一致,都能见到Ph1染色体和bcr/abl融合基因,并且FISH结果显示,间期细胞中融合细胞的比例达69.5%～93%。其余患者是确诊CML经治疗后复查Ph1染色体和bcr/abl融合基因。FISH的具体结果见表1。

表1 30例CML患者的FISH结果

3 讨 论

医学上对血液病的认识经历了形态学→遗传学→分子生物学的不同阶段,最具代表性的例子是发病率较高的慢性髓细胞性白血病(CML),目前常规检测中除了骨髓象常规分析外,还必须做染色体核型分析和融合基因的检测,因为90%以上的CML病例有 t(9;22)(q34;q11.2)易位,产生bcr/abl融合基因[2]。而常规的细胞遗传学检测中,要经历骨髓培养、收获、滴片、显带等步骤,以取得可供分析的中期分裂相,通过形态分析来辨别染色体的异常。但由于白血病细胞增殖指数低,较难获得质量好、数目多的中期分裂相,因而限制了异常染色体的检出率。本研究中30例患者的43份骨髓标本中,未做骨髓培养的6份,其余37份都做了染色体核型分析,共有9份标本骨髓标本发现Ph1染色体,包括6份CML初诊患者和3份治疗过程中发现的复发的患者,6份未找到可供分析的中期分裂相,其余标本则是Ph1染色体阴性。由此可见,常规的染色体核型分析对于初诊患者检出率较高,但不能定义阳性细胞的数量;而且对复诊病例,由于治疗后骨髓的有核细胞数很少,不易获得理想的中期分裂相,导致异常染色体的检出率不是很高。FISH技术具有灵敏度高、操作简单、快速、不受中期分裂像限制等优点,而且还能揭示某些肉眼不能辨别的基因缺失和染色体断裂,正逐步应用于染色体特殊异常的检测。ES型bcr/abl探针是一种双色单融合探针,红色信号标记于9号染色体9q34,覆盖整个abl基因及ass基因,绿色荧光信号标记于 22号染色体22q11.2,覆盖主要断裂点以上的部分bcr基因。因此在正常的间期细胞中应显示2红2绿的荧光信号,但由于bcr和abl基因在空间上无限接近或重叠,会出现融合信号的假阳性细胞。文献报道在正常骨髓标本中出现此类细胞的百分比在4%～10%[3-4],本文的阈值为8.56%,在此范围内。本组中ES型bcr/abl探针有很高的检出率,6例CML初诊患者都能检出bcr/abl融合细胞,其阳性细胞的百分数在69.5%～93%之间,大大高于8.56%的阈值水平。6例中,除了例 10和例15只做了一次FISH外,其他4例都定期用FISH做bcr/abl融合基因的检测,发现例4和例13经靶向治疗药物甲磺酸伊马替尼(格列卫)治疗后,阳性细胞的百分数都低于阈值水平,而且和RT-PCR结果一致。例18初诊显示bcr/abl融合基因阳性,经格列卫治疗3个月后,阳性细胞百分数由85%降至14%,bcr/abl融合基因仍旧阳性,说明此时还残留一定量的白血病细胞。例22则是复发病例,经3个月左右的治疗,融合细胞百分数由78%升高至85.5%,临床症状和其他实验室检查也都提示了该病例复发。由此可见,对复发病例,FISH技术由于不受细胞数量和增殖周期的影响,不仅能辅助诊断CML,而且在监测白血病微小残留病灶,判断疾病的进展上均有较高的灵敏度。

ES型bcr/abl探针中的9号染色体9q34,标记有红色荧光,覆盖整个abl基因及ass基因,ass为精氨基琥珀酸合成酶的编码基因,称为精氨基琥珀酸合成基因,位于第 9q34.1,和 abl基因相距大约200kb,全长56kb,有13～16个编码的外显子。30%左右的CML患者伴有ass基因缺失,该基因缺失的患者预后差,慢性期易急变[5]。本组6例初诊CML患者首次FISH结果中仅例22有ass缺失,且ass缺失的比例高达33%,此后的病程进展也证实了CML伴有 ass基因缺失者慢性期易急变。因此ES型bcr/abl探针可以初步判断CML患者有无ass基因缺失及预后。

综上所述,FISH技术在检测bcr/abl融合基因方面,对CML的诊断、格列卫治疗后病情的监测、ass基因缺失的初步判断都有明显的优势,可作为常规细胞遗传学的重要补充。

[1] 张之南.血液病诊断及疗效标准.2版.北京:科学出版社,1998:219

[2] Mitelman F.An International System for Human Cytogenetic Nomenclature In:Mitelman F.Guidelines for cancer cytogenetics.New York:Karger.1995:1

[3] Chase A,Grand F,Zhang Ji Guang,et al.Factors influencing the false positive and negative rates of bcr/abl fluorescence in situ hybridization.Genes Chromosom Cancer,1997,18(3):246

[4] CohenN,Novikov I,Hardan I,et al.Standardization criteria for the detection of BCR/ABL fusion in interphase nuclei of chronic myelogenous leukemia patients by fluorescence in situ hybridization.Cancer Genet Cytogenet,2000,123(2):102

[5] Stephanie A,Smoley,Stephanie R,et al.A novel tricolor,dual-fusion fluorescence in situ hybridization method to detect bcr/abl fusion in cellswith t(9;22)(q34;q11.2)associated with deletion of DNA on the derivative chromosome 9 in chronic myelocytic leukemia.Cancer Genetics and Cytogenetics,2004,148:1