神经活性甾体别孕烯醇酮对脑皮质神经元损伤的保护作用*

李贤慧，张新昌，王 刚，刘海玲，夏时海

(武警医学院分子生物学教研室，天津 300162)

神经活性甾体(neuroactive steroids)是由胆固醇或其前体在相应酶的作用下，在神经系统原位合成或经血脑屏障进入神经系统发挥作用的外周甾体及其代谢衍生物的统称[1-2]。研究表明神经甾体可以通过基因效应和非基因效应调节神经元的功能，在中枢神经系统中可发挥广泛的生物学活性[3-4]，如参与神经细胞的生长发育、成熟衰老、情绪反应、记忆过程，还参与焦虑、抑郁、惊厥、癫痫等调节过程。近年来，神经活性甾体对神经系统的保护作用日益受到关注，对防治各种神经退行性疾病极具潜力[5]。别孕烯醇酮是重要的神经活性甾体之一，它能对抗缺血引起的γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)受体功能减低[6]，还能对抗外伤性和缺血性脑损伤引起的细胞凋亡[7]，为此我们利用N-甲基-D-天门冬氨酸(N-methyl-D-aspartate，NMDA)诱发新生小鼠脑皮质神经元损伤模型，探讨神经活性甾体别孕烯醇酮对脑皮质神经元的保护作用及其机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和设备

DMEM/F12培养基为GIBCO公司产品;胎牛血清为Hyclone产品;Trizol试剂为Invitrogen产品;多聚赖氨酸(PLL)，胰蛋白酶(Trypsin)，N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)，别孕烯醇酮(allopregnanolone，Allo)均为 Sigma产品。兔多克隆 anti-Akt，anti-pAkt(Ser473)购自 Cell Signaling公司，兔多克隆Anticleaved caspase-3，Anti-cleaved caspase-9，Anti-cleaved PARP购自美国Abcam公司;小鼠抗α-tubulin单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司;HRP标记的羊抗鼠、羊抗兔二抗购自北京中山生物技术公司;凋亡DNA-Ladder提取试剂盒购自北京普利来基因技术有限公司;CO2细胞培养箱，美国Forma Scientific公司;倒置显微镜，德国Leica DMIL产品;Evergene凝胶成像分析系统，冷泉港公司。

1.2 原代脑皮质神经元培养

新生3 d小鼠低温麻醉后无菌条件下取脑，超净台内剪碎，加0.125%胰蛋白酶消化成均匀的细胞悬液，计数后1.0×106cells/ml细胞密度接种于L-多聚赖氨酸包被的6孔细胞培养板内，DMEM/F12，10%胎牛血清培养液中含阿糖胞苷(终浓度3μg/ml)抑制非神经细胞生长，置于CO2细胞培养箱37℃、5%CO2条件下培养。每2 d更换1/2新鲜培养液，培养9 d后用于实验。

1.3 别孕烯醇酮对原代脑皮质神经元的作用

培养9 d的脑皮质神经元，弃去培养液，PBS漂洗1次，再用培养液冲洗1次;加入含有Allo的培养液，终浓度分别为 0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L;实验分两组，Allo作用45 min组用于磷酸化Akt的免疫印记检测;Allo作用24h组用于β2-GABA受体mRNA的RT-PCR检测。

1.4 RT-PCR检测β2-GABA受体mRNA的表达

用Trizol试剂提取细胞总RNA;逆转录合成cDNA ，将 2μg 总 RNA 与 2μl随机引物(0.5μg/μl)混合，加DEPC水补足至终体积 12.5μl。70℃水浴变性5 min，然后立刻置冰上5 min;再加入下列试剂:M-MLV 5 ×Reaction Buffer 4μl，dNTP(10mmol/L)2μl，RNasin(40U/μl)(RNA 抑制 剂)0.5μl，MMLV(200U/μl)1μl，总体积 20μl，混匀 ，瞬时离心(5000×g，30s)，42℃反应 1 h，85℃灭活 5 min，5000×g离心1 min，保存于-70℃备用。

按常规方法PCR扩增，引物序列见表1，反应参数为95℃预变性 3 min，95℃30s，72℃延伸 30s，GAPDH退火温度58℃，25个循环;β2-GABA-R退火温度60℃，30个循环。2%琼脂糖凝胶电鉴定扩增产物泳(表1)。

Tab.1 Sequence of primers and length of PCR products

1.5 Western-blot检测磷酸化Akt

收集并裂解细胞，BCA试剂盒测定细胞总蛋白浓度，每空 30μg上样，10%SDS-PAGE 电泳分离 ，电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗 anti-pAkt(Ser 473)4℃孵育过夜;TBST洗膜后二抗孵育;TBST洗膜后，将化学发光剂A液、B液混合，滴加于膜上孵育3 min，然后用保鲜膜裹好，于暗室中进行X光压片，曝光、显影、定影。

1.6 NMDA诱导神经元凋亡及实验分组

取培养9 d的脑皮质神经元，PBS漂洗1次，再用培养液冲洗1次;加入含有Allo的培养液，30min后再加入NMDA(终浓度1×10-3mol/L)、甘氨酸(终浓度2×10-4mol/L)，作用60min后换成正常培养液继续培养24h。

实验分组，(1)对照组:正常培养液;(2)Allo 5×10-6mol/L预处理组:Allo终浓度5×10-6mol/L，NMDA终浓度1×10-3mol/L;(3)Allo 1×10-6mol/L预处理组:Allo终浓度1×10-6mol/L，NMDA终浓度1×10-3mol/L;(4)NMDA组:NMDA终浓度1×10-3mol/L。

1.7 凋亡DNA-Ladder检测

收集各组细胞，每组5×106，详细步骤按凋亡DNA-Ladder提取试剂盒(北京普利来)说明书操作。1%琼脂糖凝胶电泳，EB染色，Evergene凝胶成像分析系统成像。

1.8 Western blot检测PARP、caspase-3和 caspase-9的裂解片段

特异抗体分别为Anti-cleaved caspase-3、Anticleaved caspase-9 和 Anti-cleaved PARP，用 12%SDSPAGE电泳分离，其它基本方法步骤同1.5。

2 结果

2.1 别孕烯醇酮可促进脑皮质神经元β2-GABA受体的表达

RT-PCR检测结果显示与对照相比，0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L浓度的别孕烯醇酮均能促进β2-GABA受体mRNA的表达，密度扫描分析表明随着别孕烯醇酮浓度的增加(0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L)，β2-GABA 受体mRNA的表达量分别升高1.73±0.23倍、3.65±0.37倍和5.87±0.51倍(图1)。

Fig.1 Allopregnanolone(Allo)increased the expression of β2-GABA-R mR NAs in primary cerebral cortical neuronal cells()

2.2 别孕烯醇酮使脑皮质神经元Akt磷酸化增加

Western blot检测结果显示与对照相比，0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L浓度的别孕烯醇酮均能促进磷酸化型Akt(pAkt-Ser473)的增加，Western blot结果密度扫描分析表明随着别孕烯醇酮浓度的增加(0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和5×10-6mol/L)，pAkt-Ser473的增加量分别为2.62±0.31倍、3.85±0.55倍和4.23±0.42倍(图2)。

Fig.2 Allopregnanolone(Allo)increased Akt phosphorylation in primary cerebral cortical neuronal cells(¯x ± s)

2.3 别孕烯醇酮对NMDA诱发脑皮质神经元凋亡有保护作用

DNA-Ladder分析表明，1×10-6mol/L别孕烯醇酮预处理大鼠脑皮质神经元可使NMDA诱发的DNA-Ladder减弱，但5×10-6mol/L预处理组DNALadder减弱更明显;Western blot检测表明，与单纯NMDA诱发凋亡组比较，1×10-6mol/L别孕烯醇酮预处理能抵抗NMDA诱发的凋亡，使活化型PRAP、Caspase-9、Caspase-3的相对表达量从5.6±0.11、5.9±0.23、6.9±0.46分别降至4.2±0.26、3.8±0.34、4.3±0.29;而5×10-6mol/L别孕烯醇酮预处理组对NMDA诱发凋亡的抵抗效果更显著，使活化型PRAP、Caspase-9、Caspase-3的相对表达量分别降至1.3±0.2、1.1±0.23、1.7±0.09(图3)。

Fig.3 Pretreatment with Allopregnanolone(Allo)showed to be neuroprotective on NMDA-induced neuronal cells apoptosis()

3 讨论

研究表明神经活性甾体在中枢神经系统中的效应分为两类。一类是基因效应即神经活性甾体分子与细胞内受体结合，入核后激活转录调节相关基因的表达;另一类是非基因效应即与细胞膜上的神经递质受体如?-氨基丁酸受体、N-甲基-D-天冬氨酸受体等识别结合而快速发挥作用[1-2]。在我们的实验中脑皮质神经元经别孕烯醇酮(终浓度为0.5×10-6mol/L、1×10-6mol/L和 5×10-6mol/L)作用 24h后，RT-PCR分析表明β2-GABA受体mRNA转录增加，提示别孕烯醇酮对脑皮质神经元可产生基因效应;而作用45 min后，Western blot检测证明丝氨酸苏氨酸蛋白激酶B(Akt)磷酸化增加，提示别孕烯醇酮对脑皮质神经元也可通过神经递质受体产生瞬时的非基因效应。我们进一步的实验表明终浓度5×10-6mol/L的别孕烯醇酮预处理30min，对NMDA诱发的脑皮质神经元凋亡可产生明显的抵抗作用;提示其作用机制可能是通过促进Akt磷酸化和干扰内在的线粒体凋亡途径而抑制NMDA引起的兴奋性中毒[8]。而Veleiro等[9]的研究表明神经甾体通常是GABA受体的激动剂，可以通过增加氯离子内流而增强GABA的抑制作用是某些神经甾体减弱神经细胞兴奋性毒性的机制之一，则提示别孕烯醇酮可能通过调节GABA受体的活性进而引起Akt磷酸化增加，对神经元的凋亡起保护作用。另外我们的实验还表明别孕烯醇酮对脑皮质神经元也有基因效应，而且Marx的研究表明脑中别孕烯醇酮降低与Alzheimer's疾病相关[10]，预示着别孕烯醇酮对慢性神经退行性疾病的预防和治疗也有一定的前景。

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