中国北方汉族人群EPO基因SNP/T3541G多态性研究＊

刘海平,郑兆云,胡 扬

(1.温州医学院体育科学学院运动人体科学系,浙江 温州 325035;2.北京体育大学,北京 100084)

人类在低氧环境下产生的适应性生理性变化存在明显个体差异性。Ge等研究报道[1],在模拟海拔2800m低氧暴露24h血清促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)浓度变化存在明显的不同(-41%—400%)。Chapman等对39名长跑选手进行Hi-Lo(2500m-1250m)低氧训练研究发现[2],Hi-Lo训练后,最大摄氧量(VO2max)的变化从-3.2到18.7 ml/(min·kg)不等。目前,国外有学者认为人类在低氧环境下所产生的生理机能适应性变化及活动能力的差异性主要与决定人类生物性状的遗传物质——基因有关[3]。

促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)是促进红细胞生成增多(erythrocytosis)的关键调节因子,它促进红细胞生成增多来提高机体携氧、运氧能力。转录、表达控制生成EPO的基因是最早发现的低氧反应基因。

选取位于人类EPO基因全序列第3541 bp处,即在 EPO基因3‘端增强子上,一个 T/G单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP),简称SNP/T3541G。本文研究中国北方汉族人群SNP/T3541G的分布特征,这可能对于探索个体低氧适应差异性遗传学影响因素有着积极的理论意义。

1 材料与方法

1.1 受试对象

本研究选取北京市普通高校大学本科学生206名,男性118名,女性88名。受试者选取基本要求:汉族,祖籍为东北三省、北京、天津、内蒙河套地区及山东等省,年龄在18～22岁之间,体检合格。受试者基本情况见表1。

Tab.1 Basic conditions of 206 subjects()

Tab.1 Basic conditions of 206 subjects()

Gender n Age(yr) Height(cm) Weight(kg)Male 118 20.29±1.26 174.95±5.50 69.22±11.18 Female 88 19.96±1.38 163.03±5.10 56.97±7.67

1.2 实验方法

取静脉血2 ml,2%EDTA抗凝,用promega公司全血总DNA提取专用试剂盒提取受试者DNA。EPO基因SNP/T3541G多态性依据NCBI提供的EPO基因3‘端增强子序,利用Primer Premier 5.0引物设计软件进行引物设计。由于原基因序列3541 bp处无限制性内切酶的酶切位点,故对原序列进行引物修饰,在基因序列的3544 bp处将碱基C变为A后进行引物设计,得到一对引物,上引物:5‘ACT CTT GGC TTT TCT GTT TTC TGG G 3‘;下引物 :5‘ TAC TGC GGT G AG GCC TTGAAT GTA G3‘,引物经Blast比对具有很高的特异性,引物由上海生工生物工程有限公司合成。20μl反应体系:包括10mmol/L Tris-HCl(PH 8.3),50mmol/L KCl,1.5 mmol/L MgCl2,0.001%明胶 ,dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 200μmol/L,上下引物各 0.5μmol/L,Taq酶 1U,模板 100ng。各种均为TAK ARA产品。PCR扩增在 Gene Amp 2700进行(Perkin Elmer Cetus,Norwalk,CT)。每次取5μl扩增产物上样,在2%琼脂糖电泳,80V跑30min检验扩增效果。PCR扩增方案:(1)预变性95℃,5 min;(2)32个循环,变性94℃50s;退火56℃40s;延伸72℃60s;(3)72℃延伸7 min。扩增产物为226 bp片段。限制性内切酶AccI在37°C,5 h消化此段扩增产物,3%琼脂糖电泳,120V电压60min,EB(ethidium bromide)染色,凝胶成像系统紫外光成像(上海复日)。

1.3 数据统计

数据统计采用SPSS 11.5软件统计包(SPSS software for Windows 11.5 package)完成。中国北方汉族人群的EPO基因SNP/T3541G多态性基因型频率是否符合Hardy-weinberg遗传平衡定、及比较不同种族人群间基因型、等位基因频率差异性,采用卡方检验(chi-test,χ2)和精确率检验(Fisher exact probability test)统计。

2 结果

2.1 EPO基因SNP/T3541G的PCR-RFLP分析结果

EPO基因 SNP/T3541G位点PCR扩增产物片段为226 bp,此片段用限制性内切酶AccI消化,经37℃,5 h酶切后,产物消化为 3个长度片段,即 226 bp,201 bp,25 bp。SNP/T3541G破坏了3541 bp处的酶切位点,因此TT基因型酶切后,产生2片段即;201bp,25 bp,突变杂合TG基因型酶切后,产生3片段,226 bp,201 bp,25 bp,突变纯合 GG基因型消化后产生1片段,即226 bp。由于25 bp片段较小,在电泳时跑出琼脂糖胶,电泳图片拍照仅见2条电泳条带(图1)。

Fig.1 Electrophoretic mobility shift analysis of EPO SNP/T3541G Marker:PUC19 up to down:501 bp,489 bp,404 bp,331 bp,242 bp,190bp,147 bp,110bp

2.2 中国北方汉族人群与其它种族人群EPO基因SNP/T3541G分布特征的比较

卡方检验结果表明,中国北方汉族人群的SNP/T3541G基因型符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律(χ2(df=2)=0.05,P>0.05),SNP/T3541G的基因型和等位基因频率处于平衡状态中,中国北方汉族人群基因型和等位基因频率分别为TT为59%、TG为36%、GG为5%,等位基因T为77%、G为23%(表 2,表 3)。

中国北方汉族人群在SNP/T3541G多态位点的基因型频率与非裔美国人相比存在非常显著性差异(P<0.01),与欧洲人种相比存在显著性差异(P<0.05),TG杂合基因型频率由高至低依次为非裔美国人(40%)、中国北方汉族人群(36%)和欧洲人(29%);同时发现,在非裔美国人中突变纯合子GG基因型频率高达20%(表2)。

Tab.2 Distribution of genotype frequencies of SNP/T3541G in different ethnic population

Tab.3 Distribution of allele frequencies of SNP/T3541G in different ethnic population

中国北方汉族人群在SNP/T3541G多态位点的等位基因频率与非裔美国人相比有明显差异(P<0.05),与欧洲人相比无显著差别。

3 讨论

EPO基因是发现最早的低氧反应基因,该基因定位于7q22,由4个内含子和5个外显子组成,编码区从182 bp-763 bp,其编码表达产物 EPO通过与红系祖细胞膜上 EPOR结合,促进红系祖细胞由早期红系祖细胞(BFU-E)到晚期红系祖细胞(CFU-E)的增殖分化,最终形成成熟的红细胞释放入血,加强体内氧气运送,改善组织、器官氧水平。另外,在低氧环境下,EPO还能促进红细胞释放进入血液,最终减轻低氧对机体的损伤。同时,低氧环境下造成脑部缺血缺氧时,脑部EPO生成量成倍增加,对神经元免受低氧损伤起保护作用,且提高其存活能力。因此,研究EPO基因序列上多态位点可能对于了解不同个体对于低氧适应差异性有着积极意义。

本研究选取的SNP/T3541G多态位点定位于7q2.2的53396 bp,人类EPO基因全序列3541 bp处[4],即在人类EPO基因3‘-端低氧诱导增强子序列3323 bp和3579 bp之间。该多态位点是国内学者刘舒等于2000年首次在高原地区的汉、藏民族人群中发现报道。随后,该研究小组又观察报道了在平原居民也存在这一多态位点[5],但限于观察例数少,不具有群体代表,没能反映出SNP/T3541G在汉、藏人群中的分布特征。本研究则通过观察SNP/T3541G在206名中国北方汉族人群中的分布特征,发现该TT基因型、TG基因型、GG基因型的频率分别为59%、36%、5%;T、G等位基因频率分别为77%,23%。这是该多态位点在中国北方汉族人群中分布特点的首次报道。对于中国北方汉族人群此多态位点基因型频率与非裔美国人和欧洲人种相比均存在明显差异,中国北方汉族突变纯合子 GG基因型频率(5%)明显低于非裔美国人(20%),而杂合子TG基因型频率(36%)明显高于欧洲人(29%);等位基因频率比较研究发现,中国北方汉族人群与非裔美国人存在显著差异,即t等位基因频率低于非裔美国人,但与欧洲人相比无明显差异。

EPO基因受低氧诱导主要与其3‘端存在一个低氧诱导增强子有关,该增强子的核苷酸序列从3324p-3579bp之间,功能上可以分成三个相互作用的部分,第一部分为(site 1)核苷酸4-11序列(CACGTGCT),是低氧诱导因子-1(hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)和另外两种结构性表达的转录因子ATF-1,cyclic-AMP-responsive element-binding protein-1(CREB-1)的结合位点[3],HIF-1通过与这一位点结合,诱导EPO基因3‘端增强子的功能,促进基因的转录表达;中间部分(site 2)在17 bp～22 bp之间,由三个CA核苷酸重复子组成,特异性结合于此部位的反式作用因子可能是一种结构性表达的转录因子,其结构和性质尚不清楚,但这一部分区域发生直接影响到增强子的功能;第三部分(site 3)的核苷酸序列高度保守 ,在 DNA 反义链上该序 5’-AGGTCG ACAGGTCA-3’,由两个顺向重复子组成,该重复子是核内激素受体超家族成员的结合位点,其结合的特异性由重复子间寡核苷酸数目决定。在其基因序列3512 bp～3740bp片段作为顺式调控元件有放多因子结合,如HIF-1,肝核因子(hepatie nuclear factor-4,HNF-4)等,调节 EPO的表达,对 EPO转录起着重要作用。SNP/T3541G位于此片段间,可能与促进红细胞生成有关,有报道,对低氧适应良好的藏族人群杂合子TG基因型频率达到53%,且携带TG基因型藏族人群与高原红细胞增多症有着微相关[4,5],这一研究结果由于样本量较小,有待于进一步研究。

由此可见,不同种族人群中EPO基因SNP/T3541G多态性分布存在差异性,这对于进一步认识低氧适应个体差异性的分子生物学机理有着重要意义。

[1]Ge R L,Witkowski S,Zhang Y,et al.Determinants of erythropoietin release in response to short-term hypobaric hypoxia[J].J Appl Physiol,2002,92(6):2361-2367.

[2]Chapman R F,Stray-Gundersen J,Levine B D.Individual variation in response to altitude training[J].J Appl Physiol,1998,85(4):1448-1456.

[3]Pasha MAQ.Genomics of high altitude adaptation and maladaptation[J].High Altitude Med Biol,2004,5:249-250.

[4]刘 舒,裴澍萱,张世馥.西藏高原红细胞增多症患者红细胞生成素低氧反应增强子多态性研究 [J].中华血液学杂志,2000,21(09):486.

[5]刘艳霞,次仁布芷,张世馥.平原地区EPO基因氧敏感区增强子多态性研究 [J].西藏医药杂志,2002,23(01):8-10.