降钙素基因相关肽参与运动诱导的心脏保护作用＊

潘孝贵

(湖州师范学院体育学院,浙江 湖州 313000)

降钙素基因相关肽(calcitonin gene related peptide,CGRP)为37个氨基酸残基组成的神经肽,是目前已知最强的舒血管物质,具有显著的心脏保护作用[1]。动物实验表明,长期耐力训练后心脏CGRP含量显著提高,提示CGRP可能参与运动诱导的心脏保护作用。本研究拟在耐力训练和力竭运动动物模型的基础上,探讨CGRP在运动诱导的心脏保护中的作用及其机制,为体育锻炼预防和治疗心血管疾病提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

64只健康雄性SD大鼠(上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供),体重205 g±12 g。常规分笼喂养,室温22℃±2℃,湿度45%±10%,光照12 h/d,标准啮齿类动物饲料饲养,自由饮食。大鼠适应性饲养和跑台练习1周后将大鼠按体重分层,随机分为对照组(CG,n=16),耐力训练组(TG,n=16),力竭运动组(EG,n=16),耐力训练+力竭运动组(TEG,n=16)。CG不加干预;TG进行10周的耐力训练;EG只进行连续3 d的力竭运动;TEG完成耐力训练后48 h,再进行连续3 d的力竭运动。耐力训练计划按照Powers[2]实验方案。训练以自主运动为主,偶尔给予电刺激,每次训练结束后即刻给予巧克力(每只0.5 g),以激励大鼠运动。在10周耐力训练后48 h,TEG和EG动物进行连续3 d的力竭运动,以诱导心肌损伤。力竭运动包括5 min的热身,逐渐增加跑台速度至30m/min,坡度至6°,然后维持该运动强度,直至力竭。

1.2 实验方法

CG和TG在最后一次耐力训练48 h后取材,EG和TEG在力竭运动后即刻取材。所有大鼠戊巴比妥钠麻醉(40mg/kg,腹腔注射),腹主动脉取血,离心后取血清,-20℃保存待测。取血后,每组随机抽8只大鼠经左心室灌注固定,制备心肌石蜡切片,其余8只大鼠迅速取心脏,经预冷灭菌生理盐水清洗后,滤纸吸干,置液氮保存,待测。

心肌组织CGRP免疫反应产物分布和表达采用免疫组织化学方法(SABC法)。一抗为山羊抗人CGRP(1∶400),由Santa Cruz公司提供,SABC试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。严格按试剂盒说明书操作。染色结果定量分析采用 Image-pro Plus图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)。

缺血低氧染色采用苏木素碱性复红苦味酸染色法(HBFP染色)。

血清心肌肌钙蛋白I浓度(cardiac troponin I,cTnI)测定采用免疫化学发光法。一抗为抗人心肌肌钙蛋白I抗体。正常大鼠血清cTnI约为0.45 ng/ml。

心肌NO、SOD、MDA测定试剂盒由南京建成生物工程公司提供。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 心肌CGRP分布与表达、缺血低氧染色

免疫组织化学染色结果表明,CGRP免疫反应产物呈棕褐色,心房肌、心室肌、心内膜、心外膜、冠状动脉及其各级分支等处均有分布。其中冠状动脉周围、心房肌组织中分布较多,心室肌组织中较稀少,心外膜处可见强阳性反应,见图1 A-D。计算机图像分析表明,TGCGRP免疫反应面积和平均光密度均显著大于CG(P<0.05)。与CG比较,EG组CGRP免疫反应面积没有显著差异,平均光密度显著下降(P<0.05);与TG比较,TEG组组CGRP免疫反应面积和平均光密度均显著下降(P<0.05,表1)。

CG和TG正常心肌纤维细胞浆呈黄色,染色均匀(图2 A)。EG心肌纤维结构模糊,着色不均,细胞浆内有较多的呈斑点状或片状的缺血低氧部位,部分甚至融合成大片致密浓染(图2 B、C)。TEG组出现轻微的缺血低氧改变(图2 D)。

Fig.1 IHC staining of CGRP in rat hearts(×400)

Fig.2 HBFP staining in cardiac tissues(×400)

Tab.1 Image analysis result of CGRP IR(,n=5)

Tab.1 Image analysis result of CGRP IR(,n=5)

CG:Control group;EG:Exhaustive group;TG:Training group;TEG:Training and exhaustive group＊P<0.05vsCG;#P<0.05vsTG

Group Positive area(μm2) Average optical density(OD)CG 36.31±15.06 106.86±14.58 EG 34.27±14.21 84.54±21.27＊TG 52.31±26.05＊ 117.02±12.00＊TEG 40.31±18.26# 90.29±16.09#

2.2 血清心肌肌钙蛋白I的变化

如表2所示,EG大鼠血清心肌肌钙蛋白I浓度较CG显著升高(P<0.05),达11倍多,且超过了心肌损伤的临界值。

Tab.2 Changes of serum cTnI(,n=16)

Tab.2 Changes of serum cTnI(,n=16)

CG:Control group;EG:Exhaustive group;TG:Training group;TEG:Training and exhaustive group＊P<0.05vsCG

Group Serum cTnI(ng/ml) Increased ratio CG 0.08±0.05 11.37 EG 0.99±0.16＊TG 0.18±0.05 0.54 TEG 0.29±0.06

2.3 心肌抗氧化能力和NO的变化

由表3可知,经过10周耐力训练后,TG心肌SOD总活性显著高于CG(P<0.01)。与CG比较,EG心肌SOD总活性显著降低(P<0.01),MDA显著增加(P<0.01),NO含量显著下降(P<0.01);TEG组与TG比较,心肌SOD总活性显著降低(P<0.01),MDA含量显著增加(P<0.01)。

Tab.3 Changes of total SOD,MDA and NO in hearts( ,n=16)

Tab.3 Changes of total SOD,MDA and NO in hearts( ,n=16)

CG:Control group;EG:Exhaustive group;TG:Training group;TEG:Training and exhaustive group＊＊P<0.01vsCG;##P<0.01vsTG

Group SOD(U/mg pro)MDA(nmol/mg pro)NO(μmol/g pro)CG 118.48±25.38 20.07±5.71 2.28±0.59 EG 75.01±26.47＊＊ 31.45±7.13＊＊ 1.44±0.25＊＊TG 394.16±49.26＊＊ 19.84±4.10 2.72±0.24 TEG 242.36±42.12##25.15±9.50## 2.26±0.48

3 讨论

目前研究表明,中等强度的运动训练能够引起血浆和心肌中CGRP产生和分泌水平的升高,超负荷的运动训练则使心血管CGRP释放过多,含量下降,推测CGRP是运动诱导的心脏保护作用的重要介质之一[3]。本研究发现,耐力训练组心脏CGRP免疫反应明显增强,经过连续3 d的力竭运动后,大鼠心脏CGRP免疫反应明显减弱,未经训练大鼠血清心肌肌钙蛋白I显著升高,心肌出现较明显的缺血低氧改变,而耐力训练组大鼠则没有上述改变。提示,力竭运动使心脏中CGRP消耗过多,产生心肌细胞损伤性改变;耐力训练提高了心脏局部CGRP的含量,促使心肌收缩力增强,冠状循环和心肌局部供血改善,提高了心脏对力竭运动的耐受能力,具有心脏保护作用。

谭建新[4]发现,CGRP治疗能改善异丙肾上腺素诱导的氧化损伤,减少心肌酶CK、LDH的漏出,减轻心肌细胞损伤程度,抗膜脂质过氧化可能是其重要机制。本研究结果显示,耐力训练大鼠心肌SOD总活性显著高于对照组;力竭运动后,未受训练的大鼠和耐力训练的大鼠心肌SOD活性均显著降低,与心肌CGRP含量变化趋势相一致。提示,耐力训练可能通过提高心肌CGRP含量,上调心肌SOD活性,降低力竭运动时心肌氧化应激水平,起到心肌保护作用。

大量研究发现,NO与CGRP在调节血流方面有协同作用,并可相互促进释放:外源性NO及内源性的NO均可促进CGRP的释放,CGRP通过cAMP途径上调NOS产生NO[5]。本研究发现,耐力训练大鼠与未经训练大鼠心肌NO含量没有显著差异,但连续3天的力竭运动后,未经训练的大鼠心肌NO含量显著减少,而耐力训练的大鼠没有显著变化。提示,未经训练的大鼠由于心脏CGRP储备低,力竭运动过程中逐渐耗竭,促NO合成能力下降,心肌NO含量减少,冠脉扩张效应减弱,导致心脏冠脉灌流量不足,心肌出现缺血低氧性改变,心肌肌钙蛋白I漏出。但经过耐力训练的大鼠心脏CGRP储备高,能持久释放,促进心肌NO合成,避免了力竭运动诱导的心肌损伤。

[1]Brain SD,Grant A D.Vascular actionsof calcitonin gene-related peptide and adrenomedullin[J].Physiol Rev,2004,84(3):903-934.

[2]Powers S K,Criswell D,Lawler J,et al.Rigorous exercise training increases superoxide dismutase activity in ventricular myocardium[J].Am J Physiol,1993,265(6 Pt 2):H2094-2098.

[3]潘孝贵,潘珊珊.降钙素基因相关肽介导运动心脏重塑的机制探讨[J].上海体育学院学报,2007,31(1):54-57.

[4]谭建新,李岩松,黄宇戈,等.降钙素基因相关肽对大鼠心肌缺血损伤的影响[J].中国病理生理杂志,2000,16(3):226-228.

[5]Garry M G,Walton L P,Davis M A.Capsaicin-evoked release of immunoreactive calcitonin gene-related peptide from the spinal cord is mediated by nitric oxide but not by cyclic G MP[J].Brain Res,2000,861(2):208-219.