息贲胶囊对小鼠 Lewis肺癌组织 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表达的影响

孙长岗 ，杜忠海 ，贺珊珊

(1山东中医药大学，济南 250012;2潍坊市中医院;3潍坊医学院)

研究表明，息贲胶囊联合化疗治疗中晚期非小细胞肺癌能够明显降低化疗毒副反应，提高患者生活质量，延长生存期[1]。息贲胶囊能够抑制肿瘤细胞 DNA合成和复制，降低端粒酶活性，调节机体免疫力，进而阻滞 Lewis肺癌细胞增殖过程[2]。2010年 6～8月，我们通过观察息贲胶囊对小鼠 Lewis肺癌组织 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表达的影响，进一步揭示其抗肿瘤的作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料 C57BL/6小鼠(H-2Kb)77只，雄性，6～8周龄，体质量(20±2)g，购自中国科学院上海实验动物中心。SW-CJ-1F型超净工作台(苏净集团安全公司产品)、TGL-40B离心机(上海安亭科学仪器厂产品)、HP2AS-1000高清晰度彩色病理图像分析系统(软包购自武汉同济医科大学千屏影像工程公司)、37℃电热恒温水浴箱(上海恒丰仪器仪表有限公司产品)、恒温冰冻切片机(德国 Leica公司产品)。Lewis肺癌细胞株购自中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所;RPMI-1640培养基购自 Gibco公司;小鼠 Bax、Bcl-2单克隆抗体和 Caspase-3单克隆抗体均为 NeoMarkers生物技术公司产品;免疫组化 SABC试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。实验用药为息贲胶囊(由潍坊市中医院制剂中心生产，每粒 1.0 g，相当于生药 5 g)、顺铂(齐鲁制药有限公司，国药准字:H37021357，20 mg/支)。

1.2 方法

1.2.1 动物模型建立 取接种 Lewis肺癌 10～14天的 C57BL/6荷瘤小鼠，脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织，按肿瘤质量(g)与生理盐水(ml)1∶3制备瘤细胞悬液，200目细胞筛过滤，1 500 r/min离心5 min，用生理盐水调成浓度约 1×107/ml肿瘤细胞。取 77只小鼠，在右前腋皮下接种 Lewis肺癌瘤细胞悬液，每只 0.2 ml。

1.2.2 动物分组及处理方法 接种 24 h后，将小鼠分别按体质量标号，随机数字表法将 77只小鼠完全随机分为 5组:生理盐水组 16只、息贲胶囊低剂量[25 g/(kg◦ d)]组 16只、息贲胶囊中剂量[37.5 g/(kg◦ d)]组 15只、息贲胶囊高剂量[50 g/(kg◦d)]组 15只、顺铂组 15只。各组小鼠于用药第 21天脱颈处死，剥取瘤块，切取部分肿瘤组织，浸于10%甲醛溶液固定，48 h内常规石蜡包埋。

1.2.3 Caspase-3、Bcl-2和 Bax表达检测 采用SABC法，依据试剂盒说明书方法操作，显微镜下观察，应用图像分析系统记录各自的积分光密度值(IOD值)作为蛋白表达的量化指标。每张切片用显微镜图像采集系统采集图像，并用 Image-Pro Plus 5.0图像分析系统进行阳性显色的平均 IOD测定，平均 IOD=平均光密度 ×表达面积。

1.3 统计学方法 采用 SPSS11.0统计软件，数据结果以±s表示，组间比较采用方差分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

在实验过程中，生理盐水组及息贲胶囊低剂量组各有 1只小鼠灌胃死亡，生理盐水组另有 1只小鼠第 18天时死亡。各组小鼠瘤组织中均有不同程度 Bcl-2、Bax和 Caspase-3蛋白表达。与生理盐水组比较，各息贲胶囊组 Bax和 Caspase-3蛋白表达均上调，Bcl-2蛋白表达下调，Bax/Bcl-2比值升高(P＜0.05或 ＜0.01)，而且效应与剂量呈正相关(r=0.625，P＜0.05)。见表1。

表1 小鼠 Lewis肺癌组织中 Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表达(±s)

表1 小鼠 Lewis肺癌组织中 Caspase-3、Bcl-2和 Bax蛋白表达(±s)

注:与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01;与顺铂组比较，△P＜0.01;与息贲胶囊高剂量组比较，★P＜0.01;与息贲胶囊中剂量组比较，●P＜0.05

组别 n Bax(×103) Bcl-2(×103) Bax/Bcl-2 Caspase-3(×103)生理盐水组 14 1.98±0.23 12.36±1.14 0.15±0.02 2.59±0.17息贲胶囊低剂量组 15 2.72±0.17*★●△ 5.90±0.29**★△ 0.44±0.03**★△● 3.31±0.25*★△息贲胶囊中剂量组 15 3.40±0.32**★△ 4.49±0.26**★△ 0.75±0.09**★△ 3.75±0.42*★△息贲胶囊高剂量组 15 19.92±1.17** 2.49±0.47** 8.02±0.47** 8.13±0.46**顺铂组 15 17.37±0.69** 2.12±0.31** 6.31±0.35** 7.69±0.37**

3 讨论

Bcl-2家族是细胞凋亡重要的调控者，包括抑凋亡基因如 Bcl-2和促凋亡基因如 Bax。Bcl-2和 Bax均通过调控内质网 Ca2+参与的核内外物质转运及膜通透性转换来控制细胞色素 C从线粒体中释放，进而阻滞或诱导凋亡，Bcl-2与 Bax的比值可以决定细胞是否凋亡[3，4]。Bax/Bcl-2升高则细胞凋亡，反之细胞存活的可能性增大。

Caspase家族是一类半胱氨酸蛋白酶，在细胞凋亡过程中起着重要作用。Caspase-3被合成后通常以无活性的酶原形式存在于细胞质中，在多种凋亡信号刺激下经蛋白水解作用被激活，可对多种蛋白底物进行降解，从而在细胞凋亡过程中起关键作用，是 Caspase家族中最重要的凋亡执行者之一，参与多种因素诱导的细胞凋亡，抑制 Caspase-3的活性或拮抗其功能可使细胞凋亡受抑。当接收到细胞凋亡信号的刺激，Bcl-2/Bax比值变小，使线粒体外膜通透性升高，引起细胞色素 C释放到胞质中，激活Apaf-1，进而活化 Caspase-3启动凋亡。

本研究显示，与生理盐水组比较，息贲胶囊治疗组 Bax和 Caspase-3蛋白表达均上调，Bcl-2蛋白表达下调，Bax/Bcl-2比值升高;息贲胶囊高剂量组及顺铂组与中、低剂量组比较各指标均有统计学意义。表明息贲胶囊能下调 Bcl-2蛋白的表达，上调 Bax和 Caspase-3蛋白表达，诱导肿瘤细胞凋亡。至于息贲胶囊是否同时通过其他机制抑制肺癌组织的生长，尚有待进一步研究探讨。

[1]杜忠海，孙长岗，郑华.息贲胶囊联合 GP方案治疗中晚期非小细胞肺癌的临床观察[J].河北中医，2006，28(10):728-730.

[2]杜忠海，牛术仙，郑萍萍.息贲胶囊抗肿瘤生长及免疫调节机制的实验研究[J].山东中医杂志，2007，26(9):632-633.

[3]张甘霖，王笑民，李萍，等.固本抑瘤Ⅱ号对 Lewis肺癌荷瘤小鼠免疫功能的影响[J].中华中医药学刊，2007，25(3):489-492.

[4]Lee JU，Hosotani R，Wada M，et al.Role of Bcl-2 family proteins(Bax，Bcl-2 and Bcl-x)on cellular susceptibility to radiation in pancreatic cancer cells[J].Eur J Cancer，1999，35(9):1374-1380.