岩藻聚糖硫酸酯对高糖培养肾小球系膜细胞的影响

王秀敏 王允山 宋淑亮 梁 浩 吉爱国 (山东大学威海国际生物技术研发中心,山东 威海 264209)

转化生长因子 β1(TGF-β1)是致纤维化因子,是导致糖尿病肾病(DN)时肾小球硬化的核心因素。Ⅳ型胶原(Col-Ⅳ)作为细胞外基质(ECM)的重要成分之一,是衡量 ECM积聚的主要指标,在 DN的发病进程中起着重要作用〔1〕。由海带中提取的岩藻聚糖硫酸酯(Fucoidan,FPS)具有明显的肾脏保护作用,已经用于尿毒症早期治疗〔2〕。缬沙坦(Val)是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)受体(AT1)拮抗剂(ARB),为临床上用于治疗 DN的一线药物。本研究以 Val为阳性对照,观察FPS对高糖培养大鼠肾小球系膜细胞(GMCs)增殖和 ECM积聚的影响,为 FPS应用于 DN提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 干海带,购自山东省威海市乳山地区。大鼠肾小球系膜细胞株(HBZY-1),购自武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)。大鼠 TGF-β1ELISA试剂盒:RB公司;大鼠兔多克隆鼠 Col-Ⅳ抗体、链霉亲合素-生物素-酶复合物(SABC)免疫组化试剂盒购自武汉博士德生物技术有限公司;Val,北京诺华制药有限公司。

1.2 FPS的分离纯化 清水刷洗干海带,除去泥沙,晒干,用微型植物式样粉碎机粉碎成海带颗粒。将 1 000 g海带颗粒加入 10倍 95%乙醇,50℃,回流 0.5 h,以除去大部分色素、脂质。滤渣挥干后,以 1∶40(g∶ml)加入 60℃水中回流 3 h,搅拌速度40 r/min,回流 2次。过滤,滤液中以 20 g/L加入 CaCl2粉末,反应结束后,离心(4 000 r/min,15 min),收集上清液。减压浓缩,加入 3倍体积 95%乙醇,4℃过夜,离心(6 000 r/min,20 min),沉淀用无水乙醇、丙酮各洗 1次,干燥,得 FPS粗糖〔3〕。将 FPS粗糖配制成 1%的糖溶液,用 0.22μm的中空纤维膜过滤,除去多糖溶液杂质,经 7万～8万中空纤维膜截留,冻干,得纯 FPS。

1.3 噻唑蓝(MTT)法观察 FPS对 GMCs的增殖作用 取生长状态良好的细胞,消化成细胞悬液,按 5×105/ml浓度转种于96孔板,常规培养 24 h,换无血清培养 24 h,然后分为:正常对照组(10%FCS,含葡萄糖 5.4 mmol/L);高糖损伤组(10%FCS,含葡萄糖 30 mmol/L);Val(2×10-5、2×10-6、2×10-7mol/L)组;FPS高、中、低剂量 (500,50,5 μg/ml)组;其中用药组均用高糖培养基培养,每组设 6个复孔。分别培养 24、48、72h,加入 MTT溶液(5mg/L)酶标仪上以 595nm波长测定各孔 OD570值。

1.4 ELISA法观察 FPS对高糖刺激的 GMC培养液中 TGF-β1含量的影响 取细胞及分组方法同实验 1.3,按 5×105/ml浓度转种于 24孔板,每组设 3个复孔。培养 48 h后取上清液,每孔设 2个复孔。按照 ELISA试剂盒说明书对 TGF-β1含量进行检测。

1.5 免疫组化法观察 FPS对高糖刺激的 GMC Col-Ⅳ表达的影响 玻片处理:8 mm×8 mm盖玻片泡酸过夜,清水冲洗 20遍,无水乙醇中浸泡 6h后用超纯水冲洗 3次,放入培养皿中烘干,高压灭菌,烘干后放入超净台中备用。选取处于对数生长期的 GMCs细胞,胰酶消化制成细胞悬液;在 24孔板内每孔滴加 1滴培养基,将处理过的玻片放入空内;以 3×105/ml浓度接入 24细胞。37℃培养 24h,使细胞达到 50% ～80%融合,换无血清低糖培养基培养 24h,使细胞统一于G0期,分组及培养条件同 1.3。48h弃去培养液,用磷酸盐缓冲液(PBS)洗 2次,每孔加入 2 ml 4%多聚甲醛 4℃固定 1～1.5 h。免疫组化染色操作按照 SABC试剂盒要求。

1.6 统计学分析 采用 SPSS13.0软件,计量资料以±s表示,进行单样本正态性、方差齐性检验。运用单因素方差分析及组间数据 t检验。

2 结 果

2.1 FPS提取率 经 7万～8万中空纤维膜得截留液,浓缩,冷冻干燥后的得率为 1.01%,平均分子量为 83万D。苯酚硫酸法测得糖含量为 67.03%,氯化钡-明胶法测得硫酸根含量为38.29%。

2.2 FPS对高糖刺激的 GMC增殖的影响 高糖刺激 24 h即显著促进了系膜细胞增生,这种作用在刺激 48 h后达到了最强,72h结果显示高糖对 GMCs的增殖作用转为抑制。48 h结果显示,在此浓度范围内,各给药组均显著抑制 GMCs的增殖(P＜0.01,P＜0.05),且与剂量成正比。见表 1。

2.3 FPS对高糖刺激的 GMC培养液 TGF-β1含量的影响 高糖刺激 GMCs 48 h后,细胞分泌 TGF-β1明显增多,药物干预组均显示出了对细胞分泌TGF-β1的抑制作用,与剂量正相关。其中 FPS的高、中剂量组抑制作用明显优于低剂量组,差异有统计学意义(P＜0.05,P＜0.01),与Val相应对照组无明显差异。见表 2。

2.4 FPS对高糖刺激的GMCs中Col-Ⅳ含量的影响 高糖刺激GMCs 48 h能够使细胞分泌过多的Col-Ⅳ。正常组细胞的胞浆区几乎没有染色,高糖刺激组的细胞则可见明显的黄染。给药组均能够抑制细胞分泌过多的 Col-Ⅳ(P＜0.01),其中 FPS高剂量组抑制细胞分泌 Col-Ⅳ作用最显著(P＜0.05),效果与Val组相似。见表 2,图 1。

图1 FPS对高糖刺激的 GMCs Col-Ⅳ的影响(×400)

表1 FPS对高糖刺激的GMCs增殖的影响(±s,n=6)

表1 FPS对高糖刺激的GMCs增殖的影响(±s,n=6)

与正常组比较:1)P＜0.01;与高糖损伤组比较:2)P＜0.01

组别 24h 48 h 72 h正常组 0.500 8±0.038 0.615±0.091 0.8774±0.021高糖损伤 0.936 8±0.0261) 1.021±0.0171) 0.8664±0.014 FPS高剂量组 0.8035±0.0271)2)0.794 7±0.0312)0.694 8±0.02311)2)FPS中剂量组 0.882 8±0.0311) 0.888 4±0.011 0.8096±0.110 FPS低剂量组 0.903 3±0.0251) 0.935 7±0.014 0.8548±0.117 Val高剂量组 0.764 3±0.036 11)2)0.706 2±0.0362)0.679 1±0.0861)2)Val中剂量组 0.8056±0.037 11) 0.779 6±0.046 0.745 9±0.0331)Val低剂量组 0.8762±0.038 41) 0.856 3±0.049 0.7986±0.078

表2 FPS对高糖刺激的GMCs培养液中TGF-β 1、Col-Ⅳ的影响(±s,n=6)

表2 FPS对高糖刺激的GMCs培养液中TGF-β 1、Col-Ⅳ的影响(±s,n=6)

与正常组比较:1)P＜0.01,2)P＜0.05;与高糖损伤组比较:3)P＜0.05,4)P＜0.01

组别 TGF-β1(ng/L) Col-Ⅳ光密度值正常组 54.94±4.23 147.5±14.4高糖损伤组 93.66±5.441) 239.1±11.71)FPS高剂量组 74.13±2.991)4) 159.9±6.03)FPS中剂量组 79.29±7.351)3) 182.7±13.61)3)FPS低剂量组 88.12±6.781) 196.7±10.461)Val高剂量组 68.57±4.782)4) 157.4±12.83)Val中剂量组 75.31±4.281)3) 179.6±15.13)Val低剂量组 81.08±5.841)3) 189.9±13.41)3)

3 讨 论

GMCs属于肾脏血管周围固有细胞,是肾小球中功能最活跃的细胞,具有分泌细胞基质、产生细胞因子、吞噬和清除大分子物质及类似平滑肌细胞收缩的功能,同时也是 TGF-β1、血管内皮生长因子(VEGF)等各种细胞因子作用的主要靶细胞〔4〕。正常情况下体内系膜细胞不增殖,但在高糖等多种因素作用下,系膜细胞可发生异常的增殖,同时伴有系膜基质的增多,最终导致肾小球硬化。以往对 DN肾细胞周期的研究认为,在DN早期,高糖环境对GMCs的生长具有双向的调节作用:在培养早期(24～48 h),高糖能促进 GMCs增殖,即进行有限性增生,完成一或两轮有丝分裂;此后高糖对 GMCs增殖起抑制作用,细胞发生肥大〔5〕。细胞增殖主要与高糖激活 GMCs,表达过多血小板衍化生长因子 B(PDGF-B)及其受体 PDGFR-β有关;而细胞肥大与 TGF-β1表达过量有关〔6〕。

本研究采用体外培养大鼠 GMCs细胞株,高糖刺激细胞制造细胞损伤模型。应用 MTT法(该法可灵敏反映代谢活跃的细胞增生状态)检测高糖刺激 GMCs的增殖,结果表明:高糖刺激 24、48h后 GMCs增殖明显增强,72 h组则表现出抑制作用,与文献报道一致。FPS对高糖诱导的GMCs增殖具有显著的抑制作用,并且在一定的范围内浓度越高,其抑制作用越强,尤其FPS高剂量组则表现出优于其他用药组的抑制细胞增殖作用,表现出与 Val相似的抑制活性,而不同 FPS剂量组与对照组及模型组之间细胞存活率无明显差异,提示应用 FPS干预治疗DN时不会对肾脏系膜细胞产生毒性作用,对其临床应用的安全性提供了理论依据。

TGF-β1是目前认为最重要的致纤维化因子,是肾小球硬化过程中的核心细胞因子〔7〕,不仅能够刺激成纤维细胞的增殖还能抑制胶原酶和 Stromelysis酶的转录,增加金属蛋白酶抑制物的合成,且参与肾间质纤维化的各个细节,对肾间质中 ECM的沉积有着极重要的作用。本研究结果证实,高血糖状态下,流经肾小球的血流动力学发生改变,局部 AngⅡ浓度升高,诱导TGF-β1水平显著升高;同时高血糖可以直接促进 TGF-β1的合成。高水平的 TGF-β1通过一系列作用进一步促进DN的发生发展,主要包括:①刺激肾小球细胞 ECM合成增加,用免疫组化法证实 TGF-β1高的地方,ECM也明显积聚,基底膜明显增厚〔8〕;②刺激肾小球系膜细胞的增殖,由过碘酸-雪夫(PAS)染色结果可以判定细胞个数都大于 4个。③促进肌成纤维细胞转化进而合成及分泌间质胶原〔9,10〕,Col-Ⅳ型胶原的免疫图片证实基质增厚的地方,染色阳性也显著增加。④过度表达的TGF-β1可以通过 Smad蛋白(TGF-β1惟一受体的细胞内激酶底物,介导 TGF-β1胞内信号转导)途径实现促进细胞肥大〔11,12〕。Val作为 ARB的代表性药物,能够阻断高糖诱导的肾素-血管紧张素-醛固醇(RAS)系统激活,通过抑制 AngⅡ发挥作用实现抑制 GMCs的增殖。

Co1-Ⅳ是构成ECM的主要结构蛋白之一,也是数量最多的一种〔13〕,它构成了 ECM基本的网络样框架结构,并伴有其他系膜成分插入,形成了肾小球独特的网状微环境。DN时肾小球和肾小管ECM的Col-Ⅳ合成增加,而且肾小管的合成要早于肾小球。在层黏联蛋白(LN)作用下,其介导多种细胞的黏附,与Col-Ⅳ等多种ECM成分共同维系其动态平衡,DN时打乱平衡,在肾脏引起肾小球硬化及肾间质纤维化〔14〕。本实验中 FPS对高糖刺激的 TGF-β1、Co1-Ⅳ分泌增多有显著的抑制作用,其作用效果与浓度呈正相关。说明 FPS能够减少硬化核心因子TGF-β1的合成和分泌,延缓细胞基质的积聚,推迟肾小球的硬化进程,发挥对肾脏的保护作用。相关的作用机制可能与降低TGF-β1含量、抑制 GMCs分泌 TGF-β1、Col-Ⅳ,实现抑制 GMCs过度增殖有关。

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