蛹虫草菌丝体液体培养工艺的研究

房天琪， 邱芳萍， 王长周， 季晓枫

(长春工业大学化学与生命科学学院，吉林长春 130012)

0 引 言

蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北冬虫夏草、北虫草等，是著名的食药用菌，具有较高的食药用价值[1]，近年来，随着野生冬虫夏草资源逐渐枯竭，价格不断上涨，人们把目光瞄准了用人工培育的蛹虫草作为冬虫夏草的替代品[2]。有研究表明，人工培育蛹虫草的菌丝体和子实体具有相似的药用与滋补功效[3]。因此，采用液体发酵获得的菌丝体代替子实体生产各种药用和保键产品成为目前冬虫夏草市场亟待解决的问题[4]。本研究通过响应面分析法与PB实验相结合的方法，以菌丝体生长量为响应值[5]，采用多元二次回归拟合方程[6]，并通过求偏导获得了主要影响因子的最佳浓度配比[7]。蛹虫草液体培养进行优化试验研究，对虫草产业发展具有一定的理论与实际意义[8]。

1 实验材料

1.1 菌种

蛹虫草菌(Cordycepsm ilitaris)，由吉林蚕业研究所提供。

1.2 斜面培养基组成

每1 L培养基中含有:马铃薯200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨 20 g，KH 2 PO4 1.0 g，MgSO4◦7H 2O 0.5 g，琼脂20 g，pH自然。

1.3 种子培养基

每1 L培养基中含:土豆200 g，胡萝卜200 g，葡萄糖20 g，蛋白胨20 g，KH2PO41.0 g，MgSO4◦7H 2O 1.0 g，维生素B1 1.0 g。

1.4 试剂

其它试剂均为分析纯，长春金星化学与生物制剂有限公司购买。

2 实验方法

2.1 培养方法

将制备的供试液体培养基各取100 m L，分别装入250m L的三角瓶中，经高压蒸汽灭菌，在无菌操作台上接入1块0.5 cm2菌种块，放入恒温振荡培养箱中，在25℃，150 r/min的条件下振荡培养3 d，得到带有菌丝体球的种子液，以一定接种量转接至发酵培养液中，相同条件下培养2 d，得发酵液。

2.2 菌丝体生长量的测定

将发酵液中的菌丝体放于离心机中离心，转速设定为4 000 r/m in，时间15min，弃上清液，以去离子水洗涤沉淀3次，干燥至恒重，即得菌丝体干重。

2.3 Placket t2Burman(PB)设计

通过预实验(碳源考察和氮源考察)选择对蛹虫草菌丝体干重有正效应的影响因素，对培养基成分及培养条件进行考察，筛选影响虫草菌丝体产量的重要因素，确定最优培养基及最适培养条件，其试验因素、水平见表1。

表1 PB试验因素与水平 (g/L)

试验设计、数据分析和模型建立皆由M ini Tab 16辅助完成。

2.4 中心组合设计和响应面分析

根据Box2W il son的中心组合设计原理，以最陡爬坡试验得到的中心点，对PB试验确定的显著因素安排响应面分析试验。试验设计、数据分析和模型建立皆由Design-Expert 7.0.0辅助完成。

2.5 生长曲线的测定

采用比浊法测定虫草菌的生长曲线，以发酵时间与OD600之间的关系绘制菌丝体生长曲线。

3 结果与分析

3.1 蛹虫草液体培养基最佳碳源以及氮源的确定

图1 蛹虫草液体培养最佳碳源的选择

蛹虫草液体培养基最佳碳源以及氮源的选择分别如图1和图2所示。由图1和图2可知，以蛹虫草菌丝体干重为指标，确定最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为玉米浆。

3.2 PB试验结果

图2 蛹虫草液体培养最佳氮源的选择

通过PB试验设计方案，用M initab软件对试验数据进行分析，得到各因素对响应值Y(菌丝体干重，g/L)的影响效果见表2。

表2 因素影响效果分析

同时得到一次回归方程为:

根据表2中的检验结果可知，在99%置信区间内，葡萄糖和玉米浆的可信度分别为99.33%和99.48%，该方程的决定系数R2为98.20%，表明该回归方程拟合良好，可应用于分析和预测发酵过程中蛹虫草菌丝体的产量。

3.3 中心组合设计和响应面分析

响应值维持原始水平不变，根据爬坡试验得到的中心点，对X1，X2，X3，X7进行中心试验组合设计。为使拟合方程具有旋转性和通用性，中心点重复5次，星号臂长γ=1.414。通过自变量水平及编码试验设计结果，再利用Design-Expert中的响应面回归命令对实验数据进行分析，得到二次回归方程各因子的偏回归系数估计值及方差分析结果见表3。

表3 回归方程中回归系数的估计值及方差分析

续表3

由表3得到预测菌丝体生物量的回归方程，对回归方程各项进行方差分析可知，回归方程中包含6个显著项:A，C，D，AC，BC，CD，A2，B2，D2这9个显著项的Pr＞|t|的概率均小于0.05，得出该方程的相关系数R=0.982 0，说明该方程回归效果显著，模型可信度高，试验因子对响应值的影响可用回归方程表示为:

响应面分析法(X1，X2，X3，X7)立体分析图和相应的等高线图如图3所示。

图3 响应面分析法(X 1，X 2，X3，X7)立体分析图和相应的等高线图

图3表明，在所选因素水平范围内，均有最大响应值出现，通过数学模型预测最优的培养条件为:葡萄糖浓度 23.34 g/L，玉米浆浓度25.5 m L/L，接菌量9%，发酵温度25℃的条件下，菌丝体生物量最大预测值为15.59 g/L。为了检验模型的准确性，对此进行验证试验，共进行3批次重复试验，得到菌丝体生物量的平均值为15.56 g/L，可见该模型能很好地预测虫草发酵情况。

3.4 测定最佳培养条件下蛹虫草生长曲线

对最佳种子培养基进行菌种的培养，每隔2 h取样品测定发酵液中的菌体量，以时间与菌体量绘制生长曲线，如图4所示。

图4 蛹虫草生长曲线

从图4可以看出，菌种接入种子培养基0～28 h后，开始由生长延滞期进入对数生长期，72 h菌量达到最高峰，120 h后，细胞量开始下降后，进入静止期。因此，接种种龄取72 h为宜。

4 结 语

试验表明，在所选的碳源中，葡萄糖最有利于蛹虫草菌丝体的生长，玉米浆与无机氮源相比更易被虫草菌丝体利用，通过PB实验设计确立了最显著影响因素分别为葡萄糖浓度、玉米浆浓度、接种量、培养时间，并通过响应面软件建立这4个因素和响应值菌丝体生物量之间的数学模型，效果显著，能很好地预测菌丝体的生物量。通过验证试验，在响应面优化后所获得的实际值与预测值的最大响应值间拟合程度良好，表明中心组合设计和响应面分析法在培养基优化方面的应用具有实际指导意义。

[1] Ling JY，Sun Y J，Lu P，etal.Capillary zoneelectrophoresis determination of cordycepin in cordyceps spp Extracted by using ultrasonic[J].M ycosystema，2002，21(3):394-399.

[2] 胡征，李华屏，叶茂青.冬虫夏草菌药理功能研究进展[J].氨基酸和生物资源，2003，25(4):20-22.

[3] 张大皓，谭天伟，王炳武.响应面试验设计优化脂肪酶发酵培养基[J].北京化工大学学报，2006，33(2): 412-414.

[4] Xu C P，Kim SW，W an H J，et a1.A pp lication o f statistically based experimental designs for the optim ization of exo-polysaccharide production by Cordycepsm ilitaris NG3[J].Biotechnol App l.Biochem，2002，36:127-131.

[5] 田文莹，刘洪霞，邱芳萍.响应面法优化微波辅助提取粪奎伞菌多糖工艺的研究[J].长春工业大学学报:自然科学版，2009，30(6):629-632.

[6] 陈晋安，黄浩，郑忠辉，等.蛹虫草液体发酵条件的研究[J].集美大学学报:自然科学版，2001，6(3): 219-222.

[7] 胡昭庚.17种药用真菌栽培嗍[M].北京:中国农业出版社，1999:5-20.

[8] 连云岚，杨中林.北虫草化学成分及药理作用研究进展阴[J].山西医药杂志，2006，35(1):44-46