miRNA:急性心肌梗死治疗新战略标靶

王 虹 林英忠 (广西壮族自治区人民医院心内科，广西 南宁 530021)

微小RNA(MircroRNA，miRNA)是由21～23个核苷酸组成的内源性非编码单股小RNA，通过与目标信使RNA(messenger RNA，mRNA)的3'-非翻译端(3'-UTR)整合使其翻译减少或降解，从而调控基因的表达〔1〕，进而调控众多的生理和病理生理过程，是基因表达的重要调节器。最先确认的miRNA是控制线虫发育关键步骤的lin-4和let-7，随后的研究在包括人类、果蝇、植物等多种生物物种中通过分子克隆和生物信息学鉴别出数百个 miRNA〔2〕。

在许多疾病的发生过程中miRNA都发挥重要作用，对心血管疾病发病机制的作用正逐渐被阐明。急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)过程中的梗死缺血损伤是因血栓或冠状动脉粥样硬化斑块急性改变引发冠脉血流供应严重受损，导致心肌缺血损伤。探讨细胞对缺氧反应中特定miRNA的作用，探讨特定miRNA在AMI的细胞凋亡、纤维化、新生血管生成以及心率失常中的调控作用，不仅具有理论价值，在临床上更具有寻求AMI生物标记指标，用于诊断或评估AMI危险度，提高AMI高危病人筛选的敏感性与准确性以及针对特定miRNA进行干预治疗的临床实际应用价值。

1 miRNA及细胞对缺氧的反应及特定miRNA的调控作用

缺氧不仅发生在急性和慢性缺血后，并且在严重的病理生理环境中，如快速的组织生长，器官的发育或肿瘤的发生，高海拔状态时均会发生。氧浓度的降低会引发强烈的反应以缓解组织缺氧及细胞的不可逆性损伤。这一系列的反应包括:内皮细胞增殖、迁徙及成血管化，亦包括生长停止及细胞凋亡。其自然过程的结果取决于多种因素，如细胞来源及基因型，以及缺氧的严重程度。而且缺氧是构成肿瘤微环境的主要因素。如果肿瘤处于极度缺氧状态说明其预后极差而且对传统治疗方法有抵抗。

在缺氧时，有一系列的细胞通路及器官水平的通路被激活以恢复供氧的平衡稳定。缺氧诱发因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α(HIF-1α))无论在正常情况，还是持续缺氧状态，都通过调节两个重要的血管形成因子(内皮细胞生长因子及促血管生成蛋白因子-2)起到关键的激发新生血管形成的作用〔3〕。

在HIF-1α调节的众多基因中，miR-210被认为是在缺氧反应中起到最关键性作用的miRNA。因为在缺氧的所有细胞、组织中发现其表达升高，miRNA-210是缺氧调控唯一的所有研究均公认的miRNA〔4〕，且不受生长因子缺乏、酸中毒、过氧化的影响。研究认为 HIF-1α诱发 miR-210表达增多，故认为其是miRNA-210的最主要的调控物〔4〕。如果抑制了 HIF-1α，就可以抑制在缺氧状态下miRNA-210的产生，但如果只是抑制了HIF的主要成分HIF-2α，就无类似的作用。研究发现miRNA-210 的主要靶点是 EFNA3、E2F3、NPTX1、RAD52、ACVR1B、MNT和CASP8AP2等。提示miRNA-210参与调节细胞周期、分化、DNA修复和凋亡〔4〕。在动物实验中发现，大鼠脑短暂性局灶性缺血模型、小鼠下肢缺血模型、小鼠心衰或者心肌肥大模型中，miRNA-210表达是上调的。临床试验发现，在先兆子痫的病人中，其表达亦是上调的。

2 AMI中特定miRNA调控作用

AMI在20～30 min内其不可逆性损伤即开始，一般在严重的缺血发生后4～6 h内发生完全的梗死。由于缺氧、线粒体氧化磷酸化的迅速终止导致能量代谢的主要来源ATP的不足。确定的AMI有明确的梗死中心区带和周边区带，缺血区域从中心到周边损伤严重程度的变化，反映了再灌注缺乏程度。AMI在四个方面受特定miRNA调控。

2.1 梗死后细胞的存活 肌肉特异性miRNA-1与心肌细胞及其他细胞系统的凋亡有关。近年发现miRNA-1表达增加与缺血-灌注损伤及心肌梗死AMI后缺血凋亡细胞死亡有关。其是通过转录后抑制抗凋亡的蛋白B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)及胰岛素样生长因子-1(IGF-1)导致心肌缺血后凋亡细胞的死亡的〔5〕。

相反地，miRNA-320在缺血-灌注的心脏中无论是体内或体外实验，其表达均明显减少〔6〕。与野生型小鼠比较，miRNA-320过表达的转基因小鼠其梗死和凋亡区域增大，而抗miRNA-320治疗可以减小梗死面积，其促进凋亡的作用是直接抑制心脏保护性蛋白-热休克相关蛋白20(Hsp20)。

Dong等〔7〕发现miRNA-21在心梗后大鼠的心脏中起到保护作用，抑制凋亡。在AMI早期，梗死区miRNA-21是显著下调，而在边缘区其表达增加。其机理可能与调控程序性细胞死亡分子(PDCD)-4及激活蛋白(AP)-1有关，其体内实验证实miRNA-21的过表达可以减少梗死后心脏细胞的凋亡。但是miRNA-21在心脏生物学上其作用非常复杂和多样性，其亦参与了心脏重构和缺血预适应中抑制促凋亡基因的功能。

2.2 AMI与心律失常 miRNA-1与AMI后心律失常有关，其靶点为间隙连接蛋白43及钾离子通道亚基Kir2.1〔8〕。其上调是受到β-肾上腺素受体-cAMP-蛋白激酶A信号通路调控，β-受体阻滞剂能够部分下调miRNA-1靶点KCNJ2和GJA1的表达〔9〕。

2.3 AMI后纤维化和心脏重构 Roy等发现miRNA-21在缺血-灌注损伤心脏区域中特异性地存在，其与心肌纤维化、心脏重构有关。同源重失性磷酸张力蛋白基因(PTEN)是miRNA-21的靶点〔10〕。在心肌缺血-灌注后，心肌纤维母细胞中的miRNA-21产生抑制PTEN继而是基质金属蛋白酶-2(MMP-2)产生增加，导致心脏重构。Rooij等〔11〕发现左冠脉堵塞后，在梗死的边缘区心肌纤维母细胞中miRNA-29b表达下调。

2.4 梗死后新生血管生成 Bonauer等〔12〕发现在体外试验中发现miRNA-92a是内皮细胞内源性的血管形成的抑制物，在心肌缺血或肢端缺血的小鼠动物模型中其抑制血管形成的作用更明显。抑制miRNA-92a的表达可以改善左室功能、减少梗死面积、减少凋亡细胞数及增加血管数。

3 miRNA在AMI临床应用展望

AMI过程中对缺血起关键调节作用的特定miRNA的确定，为AMI临床诊断治疗开辟了新途径。特定miRNA可以发展作为AMI良好的相对无创性生物标记指标;特定miRNA可以发展作为AMI临床新治疗战略靶标。

3.1 miRNA作为诊断或预测的生物标记指标 疾病诊断或预测的生物标记物测定样品的采集必须是无创性的，这是一条重要的原则。miRNA一直是从血清、血浆或其他体液中取样测定。肿瘤研究表明，几百个miRNA构成的miRNA图谱比几千个mRNA构成的mRNA图谱对癌症分类更有效，特别是在组织病理无法分类时〔13〕。对于确定肿瘤病人对化疗的反应和存活，miRNA有预测意义〔14〕。miRNA在心血管疾病中潜在的诊断、预测价值，仅仅刚刚开始研究，但至今所获得的结果显示，这种作用价值不只是仅存在于肿瘤的诊断、预测。去甲肾上腺素诱发的大鼠心肌损伤模型，心脏特定miRNA-208血浆中的聚集度增高，并与典型的心肌损伤生物标记物——肌钙蛋白I的含量相关〔15〕。前述特定miRNA与AMI的研究资料提示，有理由相信通过进一步深入研究应能发现用于诊断和预测AMI，高危人群的特定miRNA生物标记指标。

3.2 miRNA作为AMI临床新治疗战略靶标 特定miRNA作为AMI临床治疗新战略靶标，至少有二个理由可以认为有突破。一是单一的miRNA可以调节多个靶基因并能够影响到整个基因网络;二是特定miRNA无论是体外还是体内，都能被有效抑制。特定miRNA还能借助某些工具定向地降低致病的或异常表达的miRNA水平，或增高具有有益功能的特定miRNA水平。由于多种核酸酶以及磷酸二酯酶能迅速降解核酸，已经开发出多种增强寡核苷酸稳定性的化学修饰方法用于调控miRNA〔16〕。

特定miRNA作为AMI临床新治疗战略靶标的可行性，已经被一个miRNA拮抗剂临床应用证实认可。这标志miRNA抑制剂可能成为一种重要的新药。该临床试验(19)是以肝脏特定miRNA-122作为C型肝炎的治疗靶标，开发应用基于锁核苷酸(LNA)的 miRNA拮抗剂调控miRNA-122，获得成功。由于miRNA-122还调控血胆固醇水平，所以这种新开发的miRNA拮抗剂也可能在心血管领域有重要的应用价值〔17〕。

3.2.1 miRNA上调 合成分子结构与干扰RNA相似的短双股寡核苷酸，可以实现miRNA的过表达，双股结构对于有效识别并定位加载到RNA诱导的沉默复合体(RISC)是必须的。合成的短双股寡核苷酸中的一股是成熟的miRNA，另一股与其互补，只有成熟miRNA进入并与RISC结合。尽管这一技术在体外试验被成功使用，但至今还没有证实在体内应用成功。

应用表达载体可以实现miRNA的持续表达。这种方法已被成功地用于增加miRNA-155表达，治疗白血病、乳腺癌、胃癌的体内试验〔18〕;还被用于证实miRNA-15a、miRNA-16在前列腺癌中起抑肿瘤基因的作用〔18〕。过表达方法有内生性miRNA过饱和进而导致内生性miRNA失调节危险。腺相关病毒所致shRNA强烈的过表达，诱发肝源性miRNA下调，肝损伤以及试验小鼠死亡〔19〕。

3.2.2 miRNA拮抗剂 miRNA拮抗剂是与目的miRNA完全互补的单股寡核苷酸，有抑制miRNA的作用。miRNA拮抗剂捆绑在成熟miRNA上，起竞争抑制作用，使特定miRNA进入RISC减少。miRNA拮抗剂也可以捆绑在miRNA前体上，阻止其进一步加工，即抑制其进入RISC或抑制其由细胞核进入细胞质。采用静脉注射经过修饰的miRNA拮抗剂全身给药方式，结果包括心脏在内的多组织，相应 miRNA表达显著降低〔20〕。用经修饰的反义RNA处理小鼠，显示miRNA-133在控制心肌肥厚〔21〕、miRNA-29 在心肌纤维化中起重要作用〔22〕。

3.2.3 miRNA海绵，miRNA橡皮擦(eraser)和miRNA面纱(mask)miRNA海绵，miRNA橡皮擦和miRNA面纱是三种不同的miRNA拮抗剂。miRNA海绵含有多个反义寡核苷酸，为防止RNA干扰切割，在通常RISC切割部位设计有凸起。miRNA橡皮擦由二个完全互补的反义寡核苷酸构成。miRNA面纱是捆绑在mRNA的miRNA目标序列上的寡核苷酸。miRNA海绵已成功在体内用于miRNA-31下调〔23〕。miRNA橡皮擦被用于证实miRNA-21的靶点是 Sprouty2〔24〕。每个miRNA可以调节数百个mRNA〔24〕，直接抑制miRNA可能影响许多下游靶基因。miRNA面纱用于抑制miRNA/mRNA关联。

3.3 运载系统 miRNA治疗的成功有赖于反义寡核苷酸或表达载体、合成的短双股寡核苷酸有效地被运载到达靶标。尽管全身给药技术有了显著的进步，但是已开发的多数核酸载体至今只证实运载到肝脏是有效的。基于RNA干预的基因治疗已经使用了数年，miRNA作为治疗靶标，需要评定载体运载核酸到达组织和细胞的能力。寡核苷酸为了穿过目的细胞的脂质双层膜，需要包裹在脂质体或纳米粒子中〔25〕。最近开发出了一种新型的脂质体(“lipidoids”)，无论其运载双股小干扰，还是单股寡核苷酸，都显示高水平的特定内生基因转录沉默〔26〕。lipidoids的初步动物(小鼠、大鼠和非人灵长类)模型试验符合安全和具体标准。

纳米技术提供了一个诱人的药物运载系统，与其他载体比较，纳米载体有相同的运载能力，而极少毒性。纳米载体已成功地应用于体外和体内，特定地杀死癌细胞而不损害健康细胞〔27〕。寡核苷酸与脂质分子，如高密度脂蛋白结合，能更好地被运送到特定器官。

病毒已被广泛用做载体，最近肿瘤基因治疗的临床试验载体就是病毒。改良腺病毒，如腺相关病毒和慢病毒，与siRNA/shRNA稳定结合并成功将其运送到达靶基因〔28〕。

miRNA抑制剂已成功用于小鼠并可能用于基于miRNA的治疗。在心血管领域，对miRNA的兴趣正在增长。研究miRNA的表达和功能，将增加对被AMI激活的分子机制以及AMI后退行性变和再生过程的调控的了解。以miRNA为靶标的AMI治疗新战略，面临的挑战包括运载系统的效率，以及其选择特定靶器官和在同一器官中选择不同细胞类型的能力。此外心脏的成纤维细胞和心肌细胞对于miRNA治疗，可能会产生与其他器官完全不同的功能结果。随着研究的深入，这些问题将会得以解决。新的AMI诊断、预测指标及治疗战略将会产生。

1 Bartel DP.MicroRNAs:genomics，biogenesis，mechanism，and function〔J〕.Cell，2004;116(2):281-97.

2 Ozsolak F，Poling LL，Wang Z，et al.Chromatin structure analyses identify miRNA promoters〔J〕.Genes Dev，2008;22(22):3172-83.

3 Pouysségur J，Dayan F，Mazure NM.Hypoxia signalling in cancer and approaches to enforce tumour regression〔J〕.Nature，2006;441(7092):437-43.

4 Crosby ME，Kulshreshtha R，Ivan M，et al.MicroRNA regulation of DNA repair gene expression in hypoxic stress〔J〕.Cancer Res，2009;69(3):1221-9.

5 Tang Y，Zheng J，Sun Y，et al.MicroRNA-1 regulates cardiomyocyte apoptosis by targeting Bcl-2〔J〕.Int Heart J，2009;50(3):377-87.

6 Ren XP，Wu J，Wang X，et al.MicroRNA-320 is involved in the regulation of cardiac ischemia/reperfusion injury by targeting heat-shock protein 20〔J〕.Circulation，2009;119(17):2357-66.

7 Dong S，Cheng Y，Yang J，et al.MicroRNA expression signature and the role of microRNA-21 in the early phase of acute myocardial infarction〔J〕.J Biol Chem，2009;284(43):29514-25.

8 Zhao Y，Ransom JF，Li A，et al.Dysregulation of cardiogenesis，cardiac conduction，and cell cycle in mice lacking miRNA-1-2〔J〕.Cell，2007;129(2):303-17.

9 Lu Y，Zhang Y，Shan H，et al.MicroRNA-1 downregulation by propranolol in a rat model of myocardial infarction:a new mechanism for ischaemic cardioprotection〔J〕.Cardiovasc Res，2009;84(3):434-41.

10 Roy S，Khanna S，Hussain SR，et al.MicroRNA expression in response to murine myocardial infarction:miR-21 regulates fibroblast metalloprotease-2 via phosphatase and tensin homologue〔J〕.Cardiovasc Res，2009;82(1):21-9.

11 Van Rooij E，Sutherland LB，Qi X，et al.Control of stress-dependent cardiac growth and gene expression by a microRNA〔J〕.Science，2007;316(5824):575-9.

12 Bonauer A，Carmona G，Iwasaki M，et al.MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice〔J〕.Science，2009;324(5935):1710-3.

13 Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers〔J〕.Nature，2005;435(7043):834-8.

14 Akamizawa J，Konishi H，Yanagisawa K，et al.Reduced expression of the let-7 microRNAs in human lung cancers in association with shortened postoperative survival〔J〕.Cancer Res，2004;64(11):3753-6.

15 Ji X，Takahashi R，Hiura Y，et al.Plasma miR-208 as a biomarker of myocardial injury〔J〕.Clin Chem，2009;55(11):1944-9.

16 Peek AS，Behlke MA.Design of active small interfering RNAs〔J〕.Curr Opin Mol Ther，2007;9(2):110-8.

17 Krützfeldt J，Rajewsky N，Braich R，et al.Silencing of microRNAs in vivo with'antagomirs'〔J〕.Nature，2005;438(7068):685-9.

18 Bonci D，Coppola V，Musumeci M，et al.The miR-15a-miR-16-1 cluster controls prostate cancer by targeting multiple oncogenic activities〔J〕.Nat Med，2008;14(11):1271-7.

19 Grimm D，Streetz KL，Jopling CL，et al.Fatality in mice due to oversaturation of cellular microRNA/short hairpin RNA pathways〔J〕.Nature，2006;441(7092):537-41.

20 Krützfeldt J，Kuwajima S，Braich R，et al.Specificity，duplex degradation and subcellular localization of antagomirs〔J〕.Nucleic Acids Res，2007;35(9):2885-92.

21 CaréA，Catalucci D，Felicetti F，et al.MicroRNA-133 controls cardiac hypertrophy〔J〕.Nat Med，2007;13(5):613-8.

22 van Rooij E，Sutherland LB，Thatcher JE，et al.Dysregulation of microRNAs after myocardial infarction reveals a role of miR-29 in cardiac fibrosis〔J〕.Proc Natl Acad Sci U SA，2008;105(35):13027-32.

23 Valastyan S，Reinhardt F，Benaich N，et al.A pleiotropically acting microRNA，miR-31，inhibits breast cancer metastasis〔J〕.Cell，2009;137(6):1032-46.

24 Sayed D，Rane S，Lypowy J，et al.MicroRNA-21 targets Sprouty 2 and promotes cellular outgrowths〔J〕.Mol Biol Cell，2008;19(8):3272-82.

25 Fenske DB，Chonn A，Cullis PR.Liposomal nanomedicines:an emerging field〔J〕.Toxicol Pathol，2008;36(1):21-9.

26 Akinc A，Zumbuehl A，Goldberg M，et al.A combinatorial library of lipid-like materials for delivery of RNAi therapeutics〔J〕.Nat Biotechnol，2008;26(5):561-9.

27 Choi Y，Thomas T，Kotlyar A，et al.Synthesis and functional evaluation of DNA-assembled polyamidoamine dendrimer clusters for cancer cellspecific targeting〔J〕.Chem Biol，2005;12(1):35-43.

28 Rubinson DA，Dillon CP，Kwiatkowski AV，et al.A lentivirus-based system to functionally silence genes in primary mammalian cells，stem cells and transgenic mice by RNA interference〔J〕.Nat Genet，2003;33(3):401-6.