基质金属蛋白酶-9和促血管生成素1、2与垂体腺瘤侵袭性的关系

张广宇 焦保华 梁朝辉 何心

基质金属蛋白酶-9和促血管生成素1、2与垂体腺瘤侵袭性的关系

张广宇*焦保华 梁朝辉*何心*

目的 研究基质金属蛋白酶-9(matrixmetalloproteinases-9，MMP-9)和促血管生成素(angiopoietin，Ang-1和Ang-2)在垂体腺瘤中的表达与其侵袭性的相关性。方法 选取垂体腺瘤手术标本40例，分侵袭组(11例)和非侵袭组(29例)，应用逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)方法对垂体腺瘤标本MMP-9、Ang-1、Ang-2 mRNA的表达进行分析。免疫组化方法对垂体腺瘤标本中MMP-9、Ang-1、Ang-2的表达进行研究。结果 MMP-9 mRNA在侵袭性垂体腺瘤表达为1.513±0.28明显高于非侵袭性垂体腺瘤的0.883±0.245(t=4.61，P＜0.05)，Ang-2 mRNA在侵袭性垂体腺瘤表达为1.455±0.28明显高于非侵袭性垂体腺瘤的0.935±0.291(t=4.37，P＜0.05)。MMP-9、Ang-2蛋白在侵袭性垂体腺瘤组中表达水平明显高于非侵袭性垂体腺瘤组(T=3.82，T=4.10，P＜0.05)。非侵袭性腺瘤组织Ang-1 mRNA表达为1.263±0.389明显高于侵袭性垂体腺瘤的0.889±0.323(t=4.46，P＜0.05)，非侵袭性垂体腺瘤组Ang-1蛋白表达明显高于侵袭性垂体腺瘤组(T=5.53，P＜0.05)。Ang-1和Ang-2表达呈负相关(r=－0.68，P＜0.05)，MMP-9、Ang-1与Ang-2在垂体腺瘤中的表达高低与患者性别、垂体瘤有无分泌功能无关。结论 MMP-9和Ang-2在侵袭性垂体腺瘤中的高表达及Ang-1在侵袭性垂体腺瘤中的低表达，可能与垂体腺瘤的侵袭性生长有关。

垂体腺瘤 MMP-9 Ang-1 Ang-2 侵袭性

垂体腺瘤呈局限性生长，一般不发生远处转移，但部分垂体腺瘤的生长可侵袭周围脑组织、血管、神经，破坏鞍区骨质，表现恶性肿瘤的特性，手术全切除十分困难，这部分垂体腺瘤被称之为侵袭性垂体腺瘤。基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)可降解细胞外基质，破坏基底膜和结缔组织，对肿瘤新生血管的形成起重要作用［1］。有文献［2］报道认为MMP-9可以作为侵袭性垂体腺瘤侵袭性的标记物之一。促血管生成素 1，2(angiopoietin，Ang 1，2)对血管发生、成熟及重塑的作用，与肿瘤细胞增殖、侵润密切相关［3］。促血管生成素在垂体腺瘤在发生、生长过程中起重要作用［4］。通过检测侵袭性垂体腺瘤和非侵袭性垂体腺瘤组织中MMP-9、Ang-1，Ang-2的mRNA和蛋白表达，探讨它们与垂体腺瘤侵袭性的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料 2007年10月至2009年9月河北医科大学第二医院神经外科手术切除的垂体腺瘤组织40例，男16例，女24例。平均年龄为(39.90±7.35)岁(17～67岁)。侵袭性垂体腺瘤判断标准:①采用Knosp的放射学分级标准［5］，3级以上归为侵袭性腺瘤;②术中见鞍底骨质及硬脑膜被侵袭破坏，肿瘤突入蝶窦腔或侵入鞍旁的血管、神经;③术中所取鞍底骨质或邻近硬脑膜经病理学证实有肿瘤侵犯。符合其中之一者即可确定为侵袭性腺瘤。侵袭性垂体腺瘤11例，其中男6例，女5例。非侵袭性垂体腺瘤29例，其中男10例，女19例。根据肿瘤有无分泌功能分:生长激素型(GH)11例，泌乳激素型(PRL)17例，非功能性垂体腺瘤12例。将术中切除的新鲜肿瘤，迅速装入无菌冻存管，投入液氮。另一部分肿瘤组织置入福尔马林液固定。主要试剂:兔抗人MMP-9、羊抗人Ang-1、羊抗人Ang-2多克隆抗体(武汉博士德)。RNA提取试剂(Invitrogen公司)逆转录酶，dNTP，Taq DNA聚合酶购自美国Promega公司。

1.2 方法

1.2.1 逆转录－聚合酶链反应(RT-PCR) 按Trizol试剂说明书提取总RNA。cDNA合成逆转录反应体系15μL。引物的序列:MMP-9引物扩增产物307bp，上游引物5'-TCCCTGGAGACCTGAGAACC-3'，下游引物5'-GGCAAGTCTTCCGAGTAGTTT-3'。Ang-1引物扩增产物 595bp，上游引物 5'-GGCTTGGTTACTCGTCAGGCTTGGTTACTCGTCA-3V，下游引物 5'-TCAGGCTGCTCTGTTTT-3'。Ang-2引物扩增产物288bp，上游引物5'-TGGAAGCCCAAGTATTA-3'，下游引物5'-TATTCACCGTGGCAGTC-3'。β-actin引物扩增产物 135 bp，上游引物:5'-CCAACTGGGACGACAT-3'，下游引物5'-TCTGGGTCATCTTCTCG-3'。PCR反应体系25 μL。扩增条件:94℃预变性5 min，72℃时加入Taq酶，扩增结束后灭活Taq酶。产物分析:取25μL扩增产物电泳，goodview染色，应用读胶仪读取各条产物带的光密度值。NIHimage1.61图像分析软件扫描分析，计算目的基因RT-PCR产物吸光度容积与β-actin基因RT-PCR产物吸光度容积的比值，作为目的基因mRNA的相对含量。

1.2.2 免疫组织化学染色 标本包埋、切片、脱蜡、水化、抗原修复，血清孵育，加一抗(1∶100)、二抗、抗链霉菌－抗生物素－过氧化酶复合物、DAB显色、苏木精复染。每次染色均置空白及阳性对照，以PBS液置换一抗作空白对照。结果判定参照IRS(immunoreactive score)半定量法［6］:①染色强度:在高倍镜下对细胞染色评分，无着色为0分、淡黄色为1分、棕黄色为2分、棕褐色为3分;②阳性范围:随机观察5个中倍视野(×200)，每个视野计数100个肿瘤细胞，将各个视野中阳性细胞数的平均百分比作为该切片的阳性细胞百分比。5%以下为0分、5%～25%为1分、26%～50%为2分、51%～75%为3分、75%以上为4分。上述两项结果相乘，0分计为阴性(－)、1～2分计为弱阳性(+)、3～6分计为中等阳性(++)、＞6分计为强阳性(+++)。

1.3 统计学方法 应用SPSS 10.0进行分析，RT-PCR测得数据用均数±标准差(±s)表示，采用两独立样本t检验。MMP-9，Ang-1，Ang-2免疫组化结果采用Wilcoxon秩和检验，指标间相关关系采用Spearman等级相关分析，与临床因素关系分析采用Pearson相关分析。

2 结果

2.1 RT-PCR结果 侵袭性组 MMP-9 mRNA，Ang-2 mRNA表达较非侵袭性组高(t值分别为4.61，4.37;P＜0.05)，见图1和表1。非侵袭性组Ang-1 mRNA表达较侵袭性组高(t=4.46;P＜0.05)。MMP-9和Ang-1，MMP-9和Ang-2之间无相关性(r值分别为0.30，0.38;P＞0.05)。Ang-1和Ang-2之间呈负相关(r=－0.68，P ＜0.05)。

图1 MMP-9，Ang-1 and Ang-2mRNA阳性表达及相应β-actin对照

表1 RT-PCR方法检测MMP-9，Ang-1、Ang-2 m RNA在侵袭性和非侵袭性垂体瘤中表达

2.2 免疫组织化学结果 MMP-9表达定位在肿瘤细胞细胞浆(图2)，Ang-1，Ang-2表达定位在肿瘤细胞和血管内皮细胞细胞浆，阳性皆呈棕黄色颗粒(图3，4)。侵袭性组MMP-9，Ang-2的表达较非侵袭性组高(T值分别为3.82，4.10，P＜0.05)。非侵袭性组Ang-1表达较侵袭性组高(T=5.53，P＜0.05)。MMP-9和Ang-1，MMP-9和 Ang-2无相关性(rs= －0.35，0.55;P＞0.05)。Ang-1和 Ang-2呈负相关(rs= －0.80，P＜0.05)(表2)。

图2 免疫组织化学反应MMP-9阳性细胞，在侵袭性垂体腺瘤中表达(A)和非侵袭性垂体腺瘤中表达(B)，肿瘤细胞胞浆呈棕色(SP法 ×400)

图3 免疫组织化学反应Ang-1阳性细胞，在侵袭性垂体腺瘤中表达(A)和非侵袭性垂体腺瘤中表达(B)，肿瘤细胞和血管内皮细胞胞浆呈棕色(SP法 ×400)

图4 免疫组织化学反应Ang-2阳性细胞，在侵袭性垂体腺瘤中表达(A)和非侵袭性垂体腺瘤中表达(B)，肿瘤细胞和血管内皮细胞胞浆呈棕色(SP法 ×400)

表2 免疫组化方法检测MMP-9，Ang-1和Ang-2在侵袭性和非侵袭性垂体瘤中表达

2.3 垂体腺瘤中MMP-9，Ang-1及Ang-2蛋白表达与患者临床特征相关性比较 三者表达经统计学处理，与患者性别、垂体腺瘤有无分泌功能无关(表3)。

表3 MMP-9，Ang-1和Ang-2在垂体腺瘤中表达与临床特征之间的关系

3 讨论

细胞外基质是细胞生存的重要内环境，对肿瘤要侵袭的周围组织来说，肿瘤细胞必须首先突破细胞外基质和基底膜组成的结构屏障，然后才能向周围组织侵袭。MMP-9能够降解细胞外基质，破坏细胞基底膜，诱导肿瘤新生血管的生成和重塑，促进肿瘤浸润和转移［1］。Kawamoto［7］等认为，MMP-9 表达不仅与垂体瘤的侵袭性密切相关，而且与肿瘤复发与否密切相关。我们的研究表明，侵袭性垂体腺瘤组中MMP-9 mRNA和蛋白表达高于非侵袭性垂体腺瘤组，表明其在垂体腺瘤的侵袭性生长过程中可能起重要作用，我们的结论与文献报道［8］一致。但是，我们的研究结果仅发现MMP-9在侵袭性垂体腺瘤中存在高表达，与患者性别、垂体瘤有无分泌功能无关，MMP-9高表达引起垂体腺瘤周围基质结构降解及其对基底膜破坏作用的具体分子学机制，尚需进一步开展体内外实验研究证实。

肿瘤由肿瘤细胞和血管构成，肿瘤细胞通过分泌血管内皮细胞生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等特异性因子，引发周围组织的血管形成，为肿瘤浸润、转移提供必须的途径［9］。通过生物学手段干扰肿瘤血管的生成，达到抑制肿瘤生长的目的已经成为抗肿瘤治疗的重要手段之一［10］。血管生成素家族包括Ang-1，2，3，4四个成员，Ang-1表达于血管周细胞和壁细胞，是内皮细胞特异性酪氨酸酶受体Tie-2最主要的激动剂，Ang1与Tie-2结合后，导致磷脂酰肌醇3-激酶/Akt途径活化，能够维持血管的完整与稳定，抑制肿瘤血管生成［11］。Ang-2由血管内皮细胞产生，它是Ang1的天然拮抗剂，作为肿瘤血管新生起始的强化因素，与肿瘤血管生成的数目和密度、肿瘤大小、肿瘤侵袭及转移密切相关［12］。Ang-2能阻断Ang-1/Tie-2通路，使血管支持细胞与血管内皮细胞的连接松解，并增加内皮细胞对VEGF等血管增殖因素的敏感性，诱导内皮细胞分裂增殖、萌芽、迁移，从而促进肿瘤生长及转移［13］。我们发现侵袭性垂体腺瘤组织中Ang-2表达上调、伴有Ang1表达下调，Ang-2能够竞争性的抑制Ang-1生物功能，降低血管的稳定性，推测Ang-2增加肿瘤的血供促肿瘤生长作用与Ang-1抑制肿瘤生长作用之间的平衡被打破，可能在侵袭性垂体腺瘤肿瘤血管形成过程中起至关重要的作用。

Ang-2能够上调包括MMP-9在内的一些蛋白水解酶的表达［14］。本研究发现MMP-9，Ang-2mRNA及其蛋白在侵袭性垂体腺瘤中表达上调，而Ang-1 mRNA及其蛋白在侵袭性垂体腺瘤组中表达较低，我们认为Ang-1和Ang-2表达比例失调可能会促进肿瘤血管形成，并在MMP-9降解细胞外基质和基底膜共同作用下，在侵袭性垂体腺瘤的侵袭生长中发挥重要作用。但是MMP-9与Ang-2在侵袭性垂体腺瘤组中的表达在本组资料中并无相关性，同样MMP-9与Ang-1也无相关性，说明在垂体腺瘤发生及侵袭过程中，虽然多数情况下有MMP-9和Ang-2的作用，但可能还有其他因素的参与，具体机制有待于进一步研究。

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The study on the association of MMP-9、Ang-1 and Ang-2 with tumor invasive behavior in human pituitary daenomas.

ZHANGGuangyu，JIAO Baohua，LIANG Chaohui，HE Xin.Department of Neurosurgery，the second affiliated Hospital of HebeiMedical University，Shijiazhuang 050000，China.Tel:0311 －87222972.

ObjectiveTo study the expression ofmatrixmetalloproteinase 9(MMP-9)，Angiopoietin-1(Ang-1)and Angiopoietin-2(Ang-2)in pituitary adenomas and explore their relationshipswith tumor invasive behavior.M ethods ThemRNA and protein expression levels of MMP-9，Ang-1 and Ang-2 were determined using RT-PCR assay and immunohistochemical technique in 40 pituitary adenoma tissues samples from surgery，respectively.The samples included 11 invasive pituitary adenomas and 29 non-invasive ones.Results ThemRNA expression levels ofMMP-9 were significantly higher in invasive pituitary adenomas than in non-invasive ones(1.513±0.28 vs 0.883±0.245)(t=4.61，P＜0.05).The mRNA expression levels of Ang-2 in invasive pituitary adenomas were higher than non-invasive ones(1.455±0.28 vs 0.935±0.291)(t=4.37，P＜0.05).The protein expression levels of MMP-9 and Ang-2 were significantly higher in invasive pituitary adenomas than in non-invasive ones(T=3.82＆T=4.10，P ＜0.05).In contrast，themRNA expression levels of Ang-1 mRNA were higher in non-invasive pituitary adenomas than in invasive ones(1.263±0.389 vs0.889±0.323)(t=4.46，P ＜0.05).The protein expression levels of Ang-1 protein were higher non-invasive pituitary adenomas than in invasive ones(T=5.53，P ＜0.05).Both Ang-2 and Ang-1 expression levelswere negatively correlated with pituitary adenomas invasion(r= －0.68，P＜0.05).There were no correlations of MMP-9，Ang-1 and Ang-2 with clinical features(P＞0.05).Conclusions Our study suggests that the expression levels ofMMP9，Ang-1 and Ang-2 may have a value to assess the invasive pituitary adenomas.

Pituitary adenomas MMP-9 Ang-1 Ang-2 Invasion

R651.1

A

* 河北医科大学第二医院神经外科(石家庄 050000)

E-mail:jiaobh2000@163.com)

2010－06－17)

(责任编辑:甘章平)

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