儿童青少年精神分裂症与GRM 5基因的全基因组关联分析和家系对照研究

栾萌 唐剑△陈星 周鹏 张燕 刘金同 刘文敏 陈刚

儿童青少年精神分裂症与GRM 5基因的全基因组关联分析和家系对照研究

栾萌*唐剑△陈星*周鹏*张燕※刘金同※刘文敏*陈刚*

目的 对既往有阳性发现的促代谢型谷氨酸受体5基因(glutamate receptor，metabotropic 5，GRM5)与精神分裂症的关联进行验证。方法 先用affymetrix 6.0芯片对89例儿童青少年精神分裂症与1000例正常对照的DNA分别进行全基因组关联分析，而后在另一个样本－100个儿童青少年精神分裂症核心家系中采用高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting，HRM)进行了 GRM5基因 6个 SNP位点 (rs591849，rs16915130，rs3899716，rs2133395，rs597462，rs1942486)的检测。用HaploView4.1软件进行数据的统计分析。结果 89例儿童青少年精神分裂症与1000例正常对照的全基因关联分析显示，GRM5基因的rs16915130位点与精神分裂症存在关联(χ2=39.895，P=2.68×10－10)，然而通过6个SNP位点及所构建的单倍型在儿童青少年精神分裂症家系的验证却不支持GRM5基因与精神分裂症关联(P＞0.05)。结论 本研究不支持GRM5基因与儿童青少年精神分裂症关联。

精神分裂症 儿童青少年 亲代谢性谷氨酸 单核苷酸多态性

多年的遗传学研究发现了精神分裂症的大量的连锁位点与关联基因［1－3］，但结果往往难以重复验证。其中，一般人群的关联对照研究中由于病例对照之间的遗传结构(人群层化)差异可能带来假阳性结果，而以家系为基础的关联对照分析可控制人群层化的混杂因素。因此，研究中可采用两种方法进行相互验证。近年来精神分裂症谷氨酸假说备受关注［4－5］，谷氨酸能基因成为了精神分裂症的主要候选基因之一。既往已有研究表明，促代谢型谷氨酸受体5(glutamate receptormetabotropic 5，GRM5)基因可能与精神分裂症关联［6－8］。故本研究采用全基因组关联分析(genomewide association study，GWAS)和核心家系研究的两步法，在中国人群中对GRM5基因与精神分裂症的关系进行了探讨。

1 对象与方法

1.1 研究对象 样本1为来自山东省精神卫生中心2005年至2008年期间的儿童青少年精神分裂症住院患者。入组标准:①符合国际疾病分类第10版(ICD-10)精神与行为障碍分类中精神分裂症的诊断标准;②年龄≤18岁。排除标准:①精神发育迟滞;②孤独症;③情感性精神病;④脑器质性疾病、酒精和药物依赖。共89例，男性45例，女性44例，年龄7～22岁，平均(16.14±2.77)岁，发病年龄7～17岁，平均(15.15±2.80)岁。对照组为来自山东省血液中心健康献血者1000名，男性569名，女性431名，年龄17～55岁，平均(23.06±6)岁。样本1的患者组和对照组用于本研究中的全基因组芯片检测。

样本2为来自山东省精神卫生中心2005年至2010年期间的儿童青少年期发病的精神分裂症患者及其健康父母组成的核心家系100个。患者的入组标准和排除标准均同样本1。其中，患儿与父母组成的家系86个，患儿与父亲或母亲组成的单亲家系14个;男性患者47例，女性患者53例，年龄7～27岁，平均(16.61±3.06)岁，发病年龄7～17岁，平均(15.66±3.16)岁。此家系样本用作GRM5基因研究的验证样本。

本研究得到了山东省医学科学院基础医学研究所伦理委员会的批准，并获得研究对象或其监护人(父母)的知情同意并签署知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 基因组DNA制备 抽取所有受试者的外周静脉血5 mL，EDTA抗凝，采用酚－氯仿法提取基因组DNA。检测DNA浓度后将所有DNA样品稀释至终浓度 20 ng/μL。

1.2.2 DNA混合池(DNA pooling)制作 对样本1中的患者组与正常对照组的每个个体取20 ng/μL浓度的DNA溶液10μL进行混合，分别构建患者组与对照组DNA混合池。用于GRM5基因检测的100个家系的DNA则稀释到2 ng/μL浓度，采用Apricot Designs PP-96-M 96 Channel Multiple-Station Personal Pipettor进行自动化DNA移液，用96孔深孔板套装200μL塑料管，大批量分装5μL DNA溶液(10 ng)，－20℃冷冻后备用。

1.2.3 单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点的检测 全基因组分析采用美国昂非(Affymetrix)公司的基因分型芯片Genome-Wide Human SNP Array 6.0芯片，包含906，600个 SNPs与946，000个检测拷贝数的探针。家系样本则仅检测GRM5基因的6 个 SNP 位点，即 rs591849，rs16915130，rs3899716，rs2133395，rs597462，rs1942486。采用高分辨率溶解曲线(High Resolution Melting，HRM)检测SNP位点的基因型。具体操作:PCR总反应体系为12.5μL，200μL塑料试管内含基因组 DNA 10 ng(5μL)，dNTPs(10 μmoL)0.25μL，10×PCR缓冲液1.25 μL，MgCl2+(25 μmoL)0.75μL，正向与反向引物(5μmoL)各 0.75 μL，Taq DNA 合成酶(Fermantas)0.5 U(5 U/μL)，SYTO9⑨ (5μmoL)3.75μL，石蜡油20μL封顶，以防蒸发。PCR反应采用两步法，预变性:94℃ 5 min，变性:94℃ 30 s，退火与延伸55℃～60℃ 1 min，50个循环，保温72℃ 7 min，最后4℃保存。高分辨率溶解曲线基因分型(HRM genotyping)在Rotor-Gene 6000荧光实时定量PCR仪上进行，变性94℃ 1 min，复性40℃3 min，然后开始缓慢升温进行高分辨率溶解检测，升温范围65℃至85℃，升温速度为0.1℃/s。

HRM基因分型采用Rotor-Gene 6000 series软件1.7版本。杂合子由于异源双链DNA存在，两次解链呈现形状特殊的曲线很容易被区分，剩下的两种纯合子由于解离温度接近，有时难以区分，要达到对其进行准确无误的基因分型，必须通过人工制造杂合子的方法。具体做法是:在第一次分型去除杂合子之后，选取一个已知分型为纯合子个体的PCR产物，加入水稀释1000倍后作为模版，进行大量PCR扩增后等量掺入所有纯合子的PCR产物中，再次进行高分辨率溶解曲线检测。掺入外源性PCR产物之后，所有纯合子中与掺入DNA的基因型不同那部分个体会变为杂合子，而掺入与自身基因型相同的那些个体的基因型则保持纯合不变，至此，两种纯合子被准确无误地分开。

1.3 统计学分析 样本1的基因分型文件中，每个SNP位点有两个信号部分组成(Signal A与Signal B)，信号的强度反映了DNA混合池样本中此位点的基因频率。由于两组DNA混合池中染色体的数量并不相等，因此将信号数值按照染色体组成数目进行换算后，再通过Excel 2007软件进行卡方检验。核心家系样本的统计分析使用Haploview 4.1软件，进行Hardy-Weinberg遗传平衡检验，单个位点的遗传连锁不平衡分析，单倍体构建与χ2检验。

2 结果

2.1 全基因组分析结果 89例精神分裂症患者与

1000名对照的全基因组关联分析表明，rs16915130位点与精神分裂症存在关联(χ2=39.895，P=2.68×10－10)。原始信号强度与等位基因转换见表1。此位点恰好位于GRM5基因内部。

2.2 核心家系的验证结果 100个核心家系的研究结果显示，所进行的 GRM基因内5个 SNP位点(rs591849， rs16915130， rs3899716， rs2133395，rs597462)与其右侧的1个SNP位点(rs1942486)无论是单个位点还是单倍体均未发现与精神分裂症关联(P ＞0.05)。见表2、3与图1。

3 讨论

许多研究表明，谷氨酸能神经递质异常与精神分裂症病理机制相关［9］。谷氨酸受体拮抗剂在人类可引起一过性精神症状，如:幻觉、妄想，以及阴性症状［10］。另外，动物实验也表明，谷氨酸能系统功能缺陷可引起类似精神分裂症的症状。谷氨酸通过两类受体调节神经元的活动:离子型和促代谢型谷氨酸受体(GRM，mGluR)。离子型受体包括三个类型:NMDA受体，AMPA受体和红藻氨酸受体。促代谢型谷氨酸受体是一种G蛋白偶联受体，它包括7个跨膜域和细胞外氨基末端区域，此受体分为三类［11］:Ⅰ类包括 mGluR1(GRM1)和mGluR5(GRM5)，这类受体与磷酸肌醇水解相关，并且能够活化磷脂酶C(PLC)。Ⅱ类受体包括mGluR2(GRM2)和 mGluR3(GRM3)，Ⅲ类受体包括mGluR4(GRM4)，mGluR6(GRM6)，mGluR7(GRM7)和mGluR8(GRM8)。mGluR5(GRM5)受体在中枢神经系统分布十分广泛，主要分布于纹状体、嗅结节、横核、海马、大脑皮质［12］。GRM5 基因定位于 11q14［6］。本研究采用了GWAS和家系关联对照研究对该基因与儿童精神分裂症的关系进行了探讨。

表1 GRM 5基因rs16915130位点原始荧光信号强度与等位基因频率转换

表2 100个儿童与青少年精神分裂症核心家系中GRM 5基因6个SNPs位点的关联分析

表3 100个儿童青少年精神分裂症核心家系中GRM 5基因SNPs位点的单倍体关联分析

图1 100个儿童青少年精神分裂症核心家系中GRM5基因6个SNPs位点的连锁不平衡分析

本研究中采用的DNA混合池方法是一种通过把许多DNA样本混合后对复杂遗传病进行关联分析的有效方法［13］。本课题组利用此方法已发现了8号染色体与精神分裂症关联、以及JARID2为精神分裂症的易感基因［14－15］。

GWAS已广泛用于精神分裂症遗传学研究，但是众多的假阳性也相伴而来。从本课题组的研究结果来看，若以P值10－6作为标准，与精神分裂症关联的位点高达3567个(数据未发表)，这远超过对精神分裂症易感基因数目的预测。而本研究中对89例儿童青少年精神分裂症与1000例正常对照的关联分析虽然发现了阳性关联位点rs16915130，但在100个儿童青少年精神分裂症核心家系却未得到验证。须考虑芯片研究结果属于假阳性，原因有二:第一，可能是DNA混合或者芯片实验误差，然而这种可能较小，因为我们用同样方法找到了JARID2基因为山东省东部隔离人群的易感基因;第二，患者组与对照组遗传结构的差异(等位基因频率差异)，这可能是最主要原因。而以家系为基础的关联分析是排除这种结果的有效方法，因为父母的遗传结构直接传递给后代，从而避免了人群层化干扰。

关联分析本质是比较患者组与对照组之间等位基因、单倍体频率的差异，但关联不单可能是与病因有关，还可能与临床异质性、遗传异质性、等位基因异质性等诸多原因相关，这是关联分析中棘手的问题。不过，全基因组外显子测序技术及全基因组测序技术可直接对DNA序列进行比对，随着这些技术的发展，在不久的将来可能可以绕过上述障碍，精神分裂症易感基因的寻找有望得到突破。

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The genome-wide association and family based association studies of the GRM 5 gene with childhood and ado-lescent onset schizophrenia.

LUAN Meng，TANG Jian，CHEN Xing，ZHOU Peng，ZHANG Yan，LIU Jintong，LIUWenmin CHEN Gang.Laboratory of Medical Geneitcs，Institute of Basic Medicine，Shandong Academy of Medical Sciences.18877 Jingshi road，Jinan 250062，China.Tel:0531 －82919507.

ObjectiveTo verify the association between GRM5 gene and schizophrenia M ethods The genome wide association study(GWS)was performed on 89 childhood and adolescentonset schizophrenia and 1000 normal controls using affymetrix 6.0 microarray.Six single nucleotide polymorphism(SNP)(rs591849，rs16915130，rs3899716，rs2133395，rs597462 and rs1942486)were detected in 100 childhood and adolescent onset schizophrenia nuclear families using High-Resolution Melting(HRM)system.Haploview 4.1 software was used to analyzed alellic and haplotipic association of the SNPs.Results GWS revealed an association of rs16915130 with schizophrenia.However，no association were detected in either allelic or haplotypic analysis in those families(P＞0.05).Conclusions Our data have not confirmed the association of GRM5 genewith the etiology of childhood and adolescentonsetschizophrenia in Shandong province of China.

Schizophrenia Childhood and adolescent Metabotropic glutamate Single nucleotide polymorphism

R749.3

A

☆国家自然科学基金(编号:30770780，30440042);山东省自然科学基金重点项目(编号:Z2008C11)

* 山东省医学科学院基础医学研究所医学遗传学实验室(济南250062)

E-mail:chengang@sdams.cn)△山东大学校医院

※山东省精神卫生中心

2010－12－24)

(责任编辑:曹莉萍)

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