KISS-1和MTA-1在侵袭性垂体腺瘤中的表达

杜安东 霍钢 张铃铛 吴留洋 冯清林 唐茂源

KISS-1和MTA-1在侵袭性垂体腺瘤中的表达

杜安东*霍钢*张铃铛*吴留洋*冯清林*唐茂源*

目的 研究肿瘤转移抑制基因KISS-1和转移相关基因MTA-1在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤中的表达情况，并分析两者与垂体腺瘤侵袭性的关系。方法 采用免疫组化SP法对31例侵袭性垂体腺瘤和28例非侵袭性垂体腺瘤组织标本KISS-1和MTA-1的蛋白表达进行检测，RT-PCR法对KISS-1和MTA-1mRNA的表达进行检测，分析它们在侵袭组和非侵袭组中的表达差异。结果 59例垂体腺瘤患者中，侵袭性垂体腺瘤组KISS-1的蛋白阳性率和mRNA表达均低于非侵袭性垂体腺瘤组(χ2=4.88，t=12.05，P＜0.05)，MTA-1的蛋白阳性率和mRNA表达均高于非侵袭性腺瘤组(χ2=5.43，t=12.99，P＜0.05)。结论 在侵袭性垂体腺瘤组织中KISS-1表达下调、MTA-1表达上调，提示可能与垂体腺瘤的侵袭性密切相关。

垂体腺瘤 KISS-1 MTA-1 侵袭性

垂体腺瘤的侵袭性主要表现在对周围组织海绵窦、蝶窦、下丘脑、鞍底骨质、邻近硬脑膜等结构的破坏［1］。因此能否抑制垂体腺瘤的侵袭和术后复发则成为决定患者预后的关键。随着肿瘤侵袭性研究的不断深入，人们研究发现肿瘤转移抑制基因 (metastasissuppressor gene 1，KISS-1)和转移相关基因 (metastasis associated gene 1，MTA-1)与肿瘤的浸润转移密切相关，在肿瘤侵袭转移的过程中起着重要的作用［2－6］。因此本研究探讨KISS-1和MTA-1与垂体腺瘤侵袭的关系，可能为研究垂体腺瘤侵袭性的机制奠定一定的基础。

1 材料与方法

1.1 临床资料 标本选自2010年3月至2010年9月重庆医科大学附属第一医院神经外科垂体腺瘤患者，实验均经患者知情同意后进行。其中男26例，女33例，年龄18～67岁，平均41.5岁。59例标本中，28例为非侵袭性垂体腺瘤，31例为侵袭性垂体腺瘤。垂体腺瘤中符合文献判断标准［7］之一者即为侵袭性垂体腺瘤。手术时取所需组织，经生理盐水洗净积血后，一部分置入4%多聚甲醛溶液内固定，另一部分新鲜肿瘤组织，置入液氮保存备用。

1.2 免疫组织化学检测(SP法) 采用SP法检测KISS-1、MTA-1蛋白的表达。组织标本经石蜡包埋5μm连续切片，1张HE染色用于重新确认病理结果，免疫组化按试剂盒操作说明进行。选择PBS代替一抗做阴性对照，其余步骤均按说明书进行。在高倍(×400)视野下计算200个肿瘤细胞(随机计数5个视野，取其平均值)，计算免疫反应阳性的细胞百分比。据免疫组织化学KISS-1及MTA-1反应阳性细胞显色强度及范围进行评价［8］:①阴性(－):无阳性细胞染色.②弱阳性(+):阳性细胞小于50%或显色浅.③强阳性(++):阳性细胞大于50%或显色深。

1.3 逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)分析 按Trizol试剂(购自宝生物工程有限公司)说明书提取总RNA，－80℃保存备用。提取的RNA含量通过752型紫外分光光度计测定260 nm吸收值，按每OD260相当于40 μgRNA计算RNA的产率，OD260在1.8～2.0视为抽提的RNA纯度很高。KISS-1上游引物序列5-ACC CTC TGG ACA TTC AC-3，下游引物序列5-CGA AGG AGT TCC AGT TGT-3，产物长度474bp;MTA-1上游引物序列5-AGC TAC GAG CAG CAC AAC GGG GT-3，下游引物序列5-CACGCT TGG TTTCCG AGG AT-3，产物长度为298bp;β-action上游引物序列5-TGA CGTGGA CAT CCG CAA AG-3，下游引物序列5-CTG GAA GGT GGA CAG CGA GGV3，产物长度200bp(KISS-1、MTA-1 引物均由上海生工生物工程有限公司设计并合成)。RT扩增条件:37℃ 15 min，85℃ 5 s;PCR扩增条件:94℃30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，循环 30 次，72 ℃ 延伸 10 min。分别取5μL产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳(含0.2 goldview);紫外灯下拍照，采用Quantity-one图像分析软件比较电泳条带光密度值，获得该样本KISS-1、MTA-1 mRNA的相对表达量。

2 结果

2.1 免疫组化显色 KISS-1染色颗粒阳性表达定位于细胞浆，有时可见于胞膜，细胞核偶见染色;MTA-1染色颗粒阳性表达定位于细胞浆或细胞核，核仁不染色(图1)。在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中KISS-1的阳性表达率分别为35.48%(11/28)和64.29%(18/31)，两组比较差异有统计学意义(χ2=4.88，P＜0.05)。在侵袭性和非侵袭性垂体腺瘤组织中MTA-1的阳性表达率分别为54.84%(17)和25.00%(7)，两组比较差异亦有统计学意义(χ2=5.43，P ＜0.05)。

2.2 RT-PCR结果 非侵袭性垂体腺瘤组 KISS-1 mRNA表达(0.667±0.075)μg较侵袭性垂体腺瘤组(0.450±0.064)μg高，差异有统计学意义(t=12.05，P＜0.05)，见图2;侵袭性垂体腺瘤组中MTA-1mRNA表达(1.353±0.098)μg较非侵袭性垂体腺瘤组(1.005±0.108)μg高，差异有统计学意义(t=12.99，P＜0.05)见图3。

图1 垂体腺瘤组织中KISS-1和MTA-1的蛋白表达。A:侵袭性垂体腺瘤组织HE染色(×400);B:侵袭性垂体腺瘤中KISS-1蛋白的阳性表达(+)(×400);C:侵袭性垂体腺瘤中MTA-1蛋白的阳性表达(+)(×400);D:垂体腺瘤阴性对照(－)(×400)

图2 KISS-1 mRNA在垂体腺瘤中的表达。1、2、3为侵袭性垂体腺瘤;4、5、6为非侵袭性垂体腺瘤;M为marker

图3 MTA-1 mRNA在垂体腺瘤中的表达。1、2为侵袭性垂体腺瘤;3、4为非侵袭性垂体腺瘤;M为marker

3 讨论

肿瘤侵袭性生长主要与某些基因的过表达或者失活及其相关蛋白、基质金属蛋白酶等因素相关。随着肿瘤转移机制分子生物学的研究深入，人们发现KISS-1和MTA-1与肿瘤的侵袭转移相关，那么它们是否在垂体腺瘤的侵袭过程中也起到一定的作用，值得我们重视和探讨。

KISS-1基因是定位于染色体lq32，含有4个外显子，大小为145个氨基酸残基的亲水性蛋白，也称metastin(或KISS-1肽或转移抑素)。经研究发现从黑色素瘤细胞转移抑制基因KISS-1的产物中分离出的多肽能够对肿瘤细胞的化学趋向性和侵袭性起到抑制作用［2］。而一些学者在食管鳞状细胞癌的研究中也发现KISS-1不仅可以抑制肿瘤细胞的侵袭，还可以抑制细胞的增值［3］。这就提示KISS-1的表达改变可能与众多肿瘤的侵袭转移相关。那么KISS-1基因是如何抑制肿瘤侵袭转移的呢?研究证实KISS-1蛋白通过与受体GPR54结合，然后激活细胞体内磷脂酶C，磷脂酶C产生胞内第二信使IP3和二甘油脂，而IP3可以促进细胞内钙离子释放，二甘油脂则可促进蛋白激酶C的活化［9］。细胞内钙离子浓度的增加可以抑制肿瘤细胞增生，诱导肿瘤细胞分化和凋亡。而蛋白激酶C对细胞分化的调节起重要作用。KISS-1还可以作用基质金属蛋白酶-9(MMP-9)，使其表达下调，本研究小组的前期工作已证实基质金属蛋白酶系统促进垂体腺瘤的侵袭性［10］，因此，KISS-1也可能通过抑制基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的表达，从而达到抑制垂体腺瘤细胞侵袭的作用。此外，KISS-1蛋白还参与肿瘤细胞局部粘附和纤维的形成，从而达到抑制肿瘤细胞侵袭转移的目的。本实验研究的结果显示KISS-1蛋白和KISS-1mRNA在侵袭性垂体腺瘤中的表达明显低于非侵袭性垂体腺瘤，这进一步说明KISS-1基因的表达下调在垂体腺瘤的侵袭中也具有一定作用。

MTA-1是在肿瘤细胞中高度表达上调且具有转移潜能的基因。目前关于MTA-1与肿瘤侵袭与转移的关系，学者研究发现:在前列腺癌［4］、绒毛膜癌［5］、肝癌［6］中，MTA-l的过表达与肿瘤的侵袭转移、血管侵犯等表型有显著相关。有研究报道在胰腺内分泌肿瘤中MTA-1基因参与肿瘤的恶性进展和转移行为，并可作为恶性胰腺内分泌肿瘤转移潜在的一种生物标志物［11］。我们研究结果显示，MTA-l蛋白及MTA-1 mRNA在侵袭性垂体腺瘤中的表达明显高于非侵袭性垂体腺瘤组织，差异有统计学意义。与其他文献报道一致，提示MTA-l蛋白高表达可能与垂体腺瘤的侵袭性生长密切相关，可能作为预测垂体腺瘤侵袭性程度的相关标志物。但是，MTA-1增加肿瘤侵袭转移潜能的分子机制还远未弄清楚，有待进一步研究。目前认为可能是通过对细胞转录水平的调控和参与信号转导来调节与肿瘤转移相关蛋白的水平:MTA-1蛋白通过与组蛋白去乙酰化酶(HDACs)结合，使HDACs到达目的区域，然后去除组蛋白的乙酰基作用于染色质，重塑其结构，使其变得更加紧密而不利于转录［12－13］。MTA-1可能就是通过此途径作用于某些抑制肿瘤浸润转移的基因，下调其转录，从而增加了肿瘤侵袭转移的潜在能力。有研究报道，MTA-1蛋白通过p53基因脱乙酰化抑制p53基因诱导的细胞凋亡［14］，可能增加了肿瘤细胞侵袭转移潜力。MTA-1还可能通过改变细胞角蛋白丝系统的组装和细胞骨架蛋白的定位，使肿瘤细胞获得更具有侵袭性和转移性的表型［15］。

本研究采用RT-PCR和免疫组化相结合的方法检测肿瘤转移抑制基因KISS-1和肿瘤相关基因MTA-1在垂体腺瘤中的表达情况。研究结果表明KISS-1的低表达或缺失和MTA-1的高表达可能与垂体腺瘤的侵袭性生长相关。但肿瘤的侵袭转移是一个多步骤复杂的生物学过程，目前对KISS-1、MTA-1在肿瘤中如何发挥生物学功能的具体机制尚未完全清楚。本次研究仅对KISS-1、MTA-1在垂体腺瘤中的作用进行了初步的探讨，对于二者在垂体腺瘤发生、发展及侵袭过程中是否存在着必然的相关性还有待于更进一步深入研究。

［1］ Monson JP.The epidemiology of endocrine tumours Endocrine Related［J］.Cancer，2000，7(12):29 － 36.

［2］ Kotani M，Detheux M，Vandenbogaerde A，et al.The metastasis suppressor gene Kiss-1 eneodes kisspeptines，the nature ligands of the orphan G-protein-CouPled receptor Gpr54 ［J］.JBiol Chem，2001，276(3):34631－34636.

［3］ Li N，Li SS，Zhang HY，et al.Effect of KISS-1 on invasive potential and proliferation of esophageal squamous carcinoma cell line EC-1［J］.Zhong Hua Bing Li Xue Za Zhi，2009，38(4):263 －267.

［4］ Kai L，Wang J，Ivanovic M，et al.Targeting prostate cancer angiogenesis throughmetastasis-associated protein1［J］.Prostate，2011，71(3):268－280.

［5］ Brüning A，Makovitzky J，Gingelmaier A，etal.Themetastasis-associated genes MTA1 and MTA3 are abundantly expressed in human placenta and chorionic carcinoma cells［J］.Histochem Cell Biol，2009，132(1):33－38.

［6］ Ryu SH，Chung YH，Lee H，et al.Metastatic tumor antigen 1 is closely associated with frequent postoperative recurrence and poor survival in patientswith hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2008，47(3):929－936.

［7］ 冯清林，霍钢，唐茂源，等.侵袭性垂体腺瘤中自噬相关基因Beclin-1和MAPLC3的表达［J］.中国神经精神疾病杂志，2010，36(8):476－479.

［8］ 李东，霍钢，王亮，等.侵袭性垂体腺瘤 smac，XIAP，caspase-3的表达［J］.中国神经精神疾病杂志，2009，35(11):673－676.

［9］ Stafford LJ，Xia C，Ma W，et al.Identification and characterization of mouse metastasis-suppressor Kiss-1 and its G-protein-coupled receptor［J］.Cancer Res，2002，62(19):5399 －5404.

［10］李九州，霍钢，郑履平，等.MMP-9、HPA及CD34在侵袭性垂体腺瘤中表达的研究［J］.中国神经精神疾病杂志，2007，33(7):404－407.

［11］ Hofer MD，Chang MC，Hirko KA，et al.Immunohistochemical and clinicopathological correlation of the metastasis-associated gene 1(MTA1)expression in benign and malignant pancreatic endocrine tumors［J］.Modern Pathology，2009，22(7):933 －939.

［12］ Mazumdar A，Wang RA，Mishra SK，et al.Transcriptional repression of oestrogen receptor by metastasis-associated protein1 corepressor［J］.Nat Cell Biol，2001，3(1):30 － 37.

［13］ Yan C，Wang H，Toh Y，et al.Repression of92-kDa type IV collagenase expression by MTAl ismediated through direct interactions with the promoter via a mechanism，which is both dependent on and independent of histone deacetylation ［J］.JBid Chem，2003，278(4):2309－2316.

［14］ Moon HE，Cheon H，Lee MS.Metastasis-associated protein 1 inhibits p53-induced apoptosis［J］.Oncology Reports，2007，18(5):1311－1314.

［15］ Hofer MD，Menke A，Genze F，et al.Expression of MTA1 promotes motility and invasiveness of PANCI pancreatic carcinoma cells［J］.Br JCancer，2004，90(2):455 －462.

The study on the expression of KISS-1 and MTA-1 in invasive pituitary adenomas.

DU Andong，HUO Gang，ZHANG Lingdang，WU Liuyang，FENGQinglin，TANGMaoyuan.Department of Neurosurgery，The First Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，NO.1 you yi road yuan jia gang，Chongqing 400016，China.Tel:023 －89011157

ObjectiveTo investigate the expression levels of tumormetastasis suppressor gene 1(KISS-1)and metastasis associated gene 1(MTA-1)in invasive and non-invasive pituitary adenomas，and to explore their relationship with the invasiveness of pituitary adenomas.Methods The mRNA and protein expression levels of KISS-1 and MTA-1 were detected using reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)and immunohistochemical SPmethod in 31 cases of invasive pituitary adenomas and 28 cases of non-invasive pituitary adenomas tissue samples，respectively.Results

In 59 pituitary adenoma cases，themRNA and protein expression levels of KISS-1 were lower in invasive pituitary adenomas than in non-invasive adenomas(χ2=4.88，t=12.05，P ＜0.05)whereas themRNA and protein expression levels of MTA-1 were higher in invasive pituitary adenomas than in non-invasive group(χ2=5.43，t=12.99，P ＜0.05).Conclusions downregulated expression of KISS-1 and upregulated expression of MTA-1 in invasive pituitary adenoma may be closely related to the invasiveness of pituitary adenomas.

Pituitary adenoma KISS-1 MTA-1 Invasiveness

R651

A

* 重庆医科大学附属第一医院神经外科(重庆 400016)

E－mail:xiaomin198171@tom.com)

2011－03－17)

(责任编辑:甘章平)

·论 著·