生物肽SP对NK细胞NKG2D/NKG2A受体表达的影响

周爱平，顾鹏毅，傅炜昕，梁再赋

(中国医科大学实验技术中心一部暨国家中医药管理局中药生物工程Ⅲ级科研实验室，辽宁沈阳110001)

P物质(Substance P，SP)是发现最早的神经肽之一，属于哺乳动物速激肽家族，广泛分布于神经系统和其他外周组织器官内，具有多种生理功能，SP发挥生理作用的主要途径是NK-1受体介导的［1］。国内外研究报道SP的镇痛作用显著强于吗啡，且无成瘾性副作用［2］。此外，SP具有消除口渴以及强化抗癌药物杀伤力的作用，有望作为抗癌病人的辅助药物。近年来SP对免疫功能的调节作用越来越受到人们的关注，已有实验证明在多种免疫细胞上均有SP的特异性受体，SP能以神经内分泌的方式作用于各种免疫细胞，参与免疫调节，促进免疫功能［1，3-4］。自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体内重要的淋巴细胞亚群，在抗感染，抗肿瘤，免疫调节及造血系统等方面发挥重要作用。目前有关SP对NK细胞功能影响的报道较少。以NK92-MI细胞作为研究体系，研究了SP对NK细胞生物学功能的调节作用，已有结果显示SP在生理浓度范围可增强NK细胞的杀伤活性，且SP通过增加杀伤介质及功能性受体的表达来调节NK细胞的杀伤功能［5］。为进一步探究SP活化NK细胞并调节其生物学活性的效应分子，还检测了SP对NK92-MI细胞活化性受体NKG2D和抑制性受体NKG2A表达的影响，以深入揭示SP对NK细胞功能影响的内在机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株NK-92MI细胞株购自中国生命科学院细胞库，用含12.5%胎牛血清和12.5%马血清的α-MEM完全培养基，传代培养;K562细胞株用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，常规培养。

1.1.2 主要试剂α-MEM干粉(GIBCO，美国)，马血清及胎牛血清(Hyclone，美国)，SP(Sigma，美国)，Real-Time PCR试剂盒(大连宝生物公司)，噻唑蓝(MTT;华美生物技术公司)，抗NKG2A-PE和抗NKG2D-APC单抗(R＆D System，美国)。

1.1.3 引物设计用Primer 6.0软件设计引物，由金斯特生物科技公司合成，引物序列见表1。

表1 Real-Time PCR所用引物Table 1 Primers used in Real-Time PCR

1.2 方法

1.2.1 MTT法测定NK92-MI细胞的杀伤活性①制备效应细胞:取对数生长期的NK92-MI细胞(4×105/mL)用不同浓度的SP(终浓度分别为10－6、10－8、10－10、10－12、10－14mol/L)作用24 h，作为效应细胞;②用96孔培养板，分别加入效应细胞和靶细胞(K562细胞)各100 μL/孔，设效、靶细胞比为4∶1;同时加入MTT(5 mg/mL，10 μL/孔)，与效、靶细胞共同孵育4 h;③将培养板离心、弃上清，加入DMSO并振荡溶解甲臢，用酶标仪于570 nm波长测定OD值。根据以下公式计算NK细胞杀伤率:

NK细胞杀伤率=(1－(实验组OD值－效应细胞对照组OD值)/靶细胞对照组OD值)×100%

1.2.2 Real-Time PCR法测定NKG2D和NKG2A的mRNA表达水平NK92-MI细胞(约1×107个)经不同浓度(终浓度分别为10－8、10－10、10－12、10－14mol/L)SP处理24 h。①异硫氰酸胍(Trizol)法提取细胞总RNA;紫外分光光度计比色，测定RNA纯度;②cDNA的合成:RT反应体系为10 μL(5×Prime Script TM缓冲液4 μL、Prime Script RT酶混合物Ⅰ0.5 μL、Oligo dT引物0.5 μL、随机引物0.5 μL、无RNA酶水3.5 μL、样品RNA 1 μL);反转录反应条件:37℃、15 min(反转录反应)，85℃、5 s(反转录酶的失活);③PCR反应:反应体系为20 μL(SYBY Primix Ex TaqTM10 μL、PCR上游引物0.4 μL、PCR下游引物0.4 μL、参比ROX DyeⅡ0.4 μL、无菌双蒸水6.8 μL、cDNA模板2 μL);反应条件:95℃，30 s(预变性);95℃，5 s;60℃，34 s(40个循环);④应用ABI PRISM 7500 Real-Time PCR System进行检测，测定各样品Ct值;以18S rRNA作为参照基因，用2－ΔΔCt法比较实验组相对表达量与对照组的倍数差异，计算公式如下:

1.2.3 流式细胞术检测NKG2D和NKG2A的膜表达取对数生长期的NK92-MI细胞与不同浓度的SP(浓度同上)共孵育24 h;用人IgG封闭Fc受体后，与荧光标记抗体(NKG2D-APC和NKG2A-PE)共同孵育30～45 min;上流式细胞仪检测细胞阳性表达率。

1.2.4 统计学分析所有数据均经SPSS13.0统计分析软件包处理，所得实验数据均以均数±标准差(¯χ±SD)表示，各组间均数比较采用一维方差分析(one-way ANOVA)，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响

SP作用24 h后，10－14～10－8mol/L的SP对NK92-MI细胞杀伤活性均有明显增强作用，与对照组比较有统计学意义;而10－6mol/L的SP对其杀伤活性无明显作用，结果见图1。

2.2 SP对NK92MI细胞NKG2D和NKG2A的mRNA水平的影响

结果如图2所示，作用24 h，各浓度SP对NK92-MI细胞NKG2D的mRNA表达均有上调作用，与对照组(无SP刺激)比较，差异有显著性(P＜0.01)。各浓度SP也可增加NK92-MI细胞NKG2A的mRNA表达，与对照组比较均有显著性差异(P＜0.01)。

图1 SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响Fig.1 Effects on NK92-MI cytotoxicity by SP

图2 SP对NK92MI细胞NKG2D/NKGA的mRNA水平的影响Fig.2 Effects on mRNA expression of NKG2D/NKG2A in NK92-MI cell by SP

2.3 SP对NK92-MI细胞NKG2D和NKG2A膜表达的影响

结果见图3、4，各浓度SP均可增加NKG2D的膜表达，与对照组(无SP刺激)比较，有显著性差异(P＜0.05);各浓度SP对NK92-MI细胞NKG2A的膜表达均有不同程度的上调，仅浓度为10－14mol/L组，与对照组比较无统计学意义。且各浓度SP刺激NKG2D表达增加的程度高于NKG2A(表2)。

表2 SP上调NK92-MI细胞NKG2D/NKG2A膜表达水平的比较Table 2 Compare in up-regulation of NKG2D and NKG2A by SP

图3 SP对NK92-MI细胞NKG2D膜表达的影响Fig.3 Effects on expression of NKG2D in NK92-MI cell by SP

图4 SP对NK92-MI细胞NKG2A膜表达的影响Fig.4 Effects on expression of NKG2A in NK92-MI cell by SP

3 讨论

SP是体内最常见的神经肽，是神经内分泌和免疫系统共同的化学语言。SP对免疫功能的多个方面均有促进作用，在体内体外均可调节多种免疫细胞的功能［3，6-7］。SP可以影响淋巴细胞的增殖、分化，诱导免疫球蛋白和细胞因子的合成，并能够调节Th细胞的活性和其他一些免疫细胞的活性。SP对杀伤性淋巴细胞的活性也有影响，SP可刺激外周血NK细胞的迁移和细胞毒活性，并调节炎症部位的NK细胞分泌IFN-γ，某些疾病状态至外周血SP浓度升高而抑制NK细胞杀伤活性，也有研究表明过高浓度的SP对外周血NK细胞的杀伤活性有下调作用［7-9］。可见，SP在不同条件下所起的作用具有复杂性和多样性。我们已经证实SP对人外周血中NK细胞杀伤活性有双向调节作用，本项研究应用NK92-MI细胞为研究对象，通过MTT比色法检测SP对NK92-MI细胞杀伤活性的影响，结果显示较低浓度(10－14～10－8mol/L)的SP对NK-92MI细胞的细胞毒性有明显的增强作用(效靶细胞比为4∶1)，说明生理浓度范围的SP可促进NK细胞的杀伤活性。

NK细胞是机体天然存在的抗肿瘤细胞，无需预先致敏，无MHC限制性，能直接杀伤靶细胞，其活性的高低与疾病的发生、发展及转归有密切的关系。NK细胞受体基因的平衡对维持NK细胞和/或T细胞受体平衡和机体的免疫自稳状态意义重大。NK细胞受体是其功能发挥的分子基础，NK细胞依赖于其表面表达的多种能与MHC或非MHC配体结合的受体，传递活化或抑制信号，调节其生物学活性［10］。活化性受体NKG2D表达于所有静止和活化的人类NK细胞，但NKG2D与其他NKG2蛋白无同源性，同CD94也没有关系，人类NKG2D受体仅与DAP10蛋白结合。当前已证明NKG2D受体启动NK细胞细胞毒性机制依赖于颗粒分泌途径，NKG2D/DAP10与其相应配体分子结合后，激活自然杀伤细胞内的Jak2、Stat5、MIPK和AKt/蛋白激酶等多糖信号转导途径，拮抗MHCⅠ类分子所转导的抑制信号，激活自然杀伤细胞的细胞毒性，即NKG2D-DAP10复合体的交联引发细胞颗粒释放和细胞毒作用［11-12］。不同NK细胞亚群细胞表达不同抑制性受体KIR和CD94/NKG2A组合，CD94/NKG2A的配体是HLA-E分子，表达于靶细胞上的HLA-E分子对CD94/NKG2A+NK细胞的杀伤活性具有抑制作用［11］。CD94/NKG2和KIR在功能上相互补充，这使得NK细胞对不同病理情况引发的HLA表达的细微和较大变化均有感应。NKG2A和NKG2D平衡的变化很大程度上决定着NK细胞的功能状态，抑制性受体介导抑制信号的质和量帮助决定NKG2D介导效应功能的水平。

为进一步探讨NK92-MI细胞的杀伤功能增强的原因，通过流式细胞术和Real-Time PCR检测对杀伤活性有增强作用的浓度范围的SP对NK92-MI细胞表面NKG2D/NKG2A表达水平的影响。结果表明各浓度SP均上调NKG2D的膜表达和mRNA水平(两者变化趋势完全一致);该浓度范围的SP同样可明显增强NKG2A的mRNA表达，仅10－14mol/L的SP对NKG2A膜表达的作用较对照组无差别，提示此组NKG2A膜表达受到抑制;其他浓度的SP使NK92-MI细胞NKG2D膜表达上调的幅度相对较大，说明NKG2A/NKG2D平衡被打破，活化信号超过抑制信号而占优势，进而诱导NK92-MI细胞产生和分泌杀伤介质、发挥杀伤功能。而且已研究证实SP可以通过促进杀伤介质穿孔素和颗粒酶的产生及增加NK细胞独有的活化性受体NCR的表达来调控NK细胞的杀伤活性［5］。

综上所述，生理浓度的SP可以增强NK细胞的杀伤活性，SP调节NK细胞功能性受体NKG2A/NKG2D的表达强度，可能为其调控NK细胞杀伤活性的分子机制之一。临床应用NK细胞进行过继生物治疗时，SP的联合应用即可保证NK细胞杀伤肿瘤的效果，还可以缓解病人的疼痛、口渴等症状。为了进一步确定这种可能性，今后将建立动物模型进行体内实验，深入研究NK细胞联合应用SP的治疗作用及其作用机制。

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