链霉菌11371基因工程宿主菌的确定

陈飞，吴红艳，桓明辉，关艳丽，郭玲玲，修翠娟

(辽宁省微生物科学研究院，辽宁朝阳122000)

链霉菌11371内源性质粒pSAL1和pSAL2的存在影响链霉菌质粒pIJ702的转化［1］，链霉菌11371只含有pSAL1衍生菌U3具有转化pIJ702的能力［2］，为提高U3对pIJ702转化率，构建11371转化体系，本研究采用接合转移的方法消除U3中的pSAL1。以U3作为接合转移质粒供体菌，以缺失pSAL1和pSAL2的不吸水链霉菌11371衍生菌种P2、P5、P7［2］作为接合转移质粒受体菌进行接合转移。由于U3和P2、P5、P7属于同一种菌，更易发生接合转移，期望通过接合转移的方法可以消除U3中的大质粒，提高U3转化率。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌种链霉菌11371(Streptomyces ahygroscopicus wuzhouensis subsp)衍生菌U3、P2、P5、P7由辽宁省微生物科学研究院菌种中心提供;变铅青链霉菌TK54(S.lividans TK54)由中国科学院北京微生物研究所谭华荣教授惠赠。

1.1.2 培养基与试剂R2YE培养基、菌丝生长培养液、液体发酵培养基、PDA培养基等，配方见文献［1］;试剂硫链丝菌素、乙酸钾、Tris、TE25S、BamHI、BglII、PstI、DNA Maker等购自北京科海军舟有限公司。

1.2 方法

1.2.1 外源质粒pIJ702转化P2和U3［2］参考文献［2］的方法，进行外源质粒pIJ702转化P2的实验。

1.2.2 来自P2和U3的pIJ702'转化链霉菌11371参考文献［2］的方法，进行来自P2和U3的pIJ702'转化链霉菌11371的实验。①pIJ702质粒的提取:参考文献［2］的方法，进行质粒提取;②pIJ702质粒的转化:参考文献［2］的方法，进行质粒转化。

1.2.3 链霉菌11371衍生菌种孢子悬液制备方法参考文献［3］的方法，制备孢子悬浊液。

1.2.4 接合转移以U3为供体菌，P7、P2、P5、变铅青链霉菌TK54为受体菌，其中U3为消除一个内源性质粒的链霉菌11371衍生菌，P7、P2、P5为消除2个内源性质粒的链霉菌11371的衍生菌，TK54为链霉菌模式菌，其不含有内源性质粒。①涂布受体菌P7、P2、P5和TK54:孢子悬液计数，以100、10－1、10－2稀释浓度分别在R2YE培养基涂布无内源性质粒的菌体，选择适当浓度使孢子群体的密度足以揭示麻点的出现;受体菌培养不同的时间，观察菌落生长状态;②涂布供体菌U3:选择合适的受体菌培养平板，将不同孢子浓度的供体菌涂布或划线于受体菌培养基中，28℃培养;③麻点的形成和纯化:挑取形成的麻点中间菌丝，划线于新的R2YE培养平板上，培养后挑取菌落周围存有透明圈的单菌落，培养后保存待用;④接合转移供体菌菌体包埋块的制备:参考文献［2］的方法，进行接合转移供体菌菌体包埋块的制备;⑤高压脉冲电泳:参考文献［2］的方法，进行高压脉冲电泳。

1.2.5 接合转移子宿主性能鉴定［2，4-7］①接合转移子生物活性的测定:参考文献［2］的方法，进行接合转移子生物活性的测定;②接合转移子内源性质粒的测定:参考文献［4］、［5］的方法，进行接合转移子内源性质粒的测定;③外源质粒pIJ702对接合转移子的转化:参考文献［2］、［6］、［7］的方法，进行外源质粒pIJ702对接合转移子的转化。

2 结果与分析

2.1 接合转移子(麻点)的筛选

通过接合转移试验，获得8个麻点形成的培养平板，图1、图2、图3分别是U3-P7-1、U3-P7-6、U3-P7-8。

图1 U3-P7-1接合转移子Fig.1 U3-P7-1 transfer of zygosis

图2 U3-P7-6结合转移子Fig.2 U3-P7-6 transfer of zygosis

图3 U3-P7-8结合转移子Fig.3 U3-P7-8 transfer of zygosis

2.2 接合转移子宿主菌性能确定

通过对接合转移子筛选，以期获得具有高转化率的链霉菌11371的衍生菌种，用于筛选出链霉菌11371基因工程宿主菌。由表1可知，接合转移子U3-P7-6具有转化外源质粒的能力，转化率为17～20个/100个菌。比U3的转化率有所提高，而且具有生物活性，因此确定U3-P7-6为链霉菌11371宿主菌。

表1 接合转移子宿主性能鉴定Table 1 Certification of gene Host strain of transfer of zygosis

3 讨论

链霉菌在接合转移过程中可能出现如下4种结果:①供体和转移接合子产生一样的闭合环状DNA;②供体和转移接合子均未分离到共价闭合环状DNA;③转移接合子中分离共价闭合环状DNA，但在供体中没有分离到;④供体发现闭合环状DNA，而转移接合子中未发现。链霉菌接合转移研究初期，只证明了共价闭合环中DNA可以发生接合转移，最近研究表明，线性质粒也可以发生接合转移。链霉菌11371中含有2个线性质粒，也可以发生接合转移。本研究利用上述③的结论，选择供体菌种是含有1个内源性质粒的链霉菌11371衍生菌U3，受体菌为不含有内源性质粒的衍生菌P7、P2、P5和链霉菌模式菌TK24，分别进行接合转移，得到具有活性的缺失2个内源性质粒的衍生菌U3-P7-6，通过来自P2和U3的pIJ702'转化U3-P7-6试验证明其具有较高的转化率(17～20个转化子/100个菌落)，初步确定为链霉菌11371基因工程宿主菌。

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［6］ Gusek T W，Kinsella J E.Review of the Streptomyces lividans/vector pIJ702 system for gene cloning［J］.Crit Rev Microbiol，1992，18(4):247-260.

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