马氏珠母贝高F值寡肽体外抗氧化研究

郑惠娜章超桦吉宏武秦小明

（1.水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

马氏珠母贝高F值寡肽体外抗氧化研究

郑惠娜1，2章超桦1，2吉宏武1，2秦小明1，2

（1.水产品深加工广东普通高校重点实验室，广东 湛江 524088；2.广东海洋大学食品科技学院，广东 湛江 524088）

研究马氏珠母贝高F值寡肽（PHFP）的体外抗氧化及其对H2O2诱导L02肝细胞损伤的保护作用。结果表明：马氏珠母贝高F值寡肽对·OH、DPPH·及O－2·均具有一定的清除能力。在浓度为10mg/mL时，对3种自由基的清除率分别达到了60.8%、50.8%和44.2%。剂量为1mg/mL的高F值寡肽使H2O2诱导损伤L02肝细胞的半数致死剂量LD50由 损 伤 模 型 组 的0.618mmol/L 提 高 到0.737mmol/L，提高了19.3%。

马氏珠母贝；高F值寡肽；抗氧化活性

高F值寡肽是由3～7个氨基酸残基组成的混合小肽体系，具有高支低芳的氨基酸组成模式，可用于辅助治疗肝性脑病、肝硬化、纠正血浆及脑中的氨基酸病态模式。1991年日本学者Soichi［1］研究证实了玉米高F值寡肽混合物能够有效用于辅助治疗肝脏疾病。中国学者王梅［2－3］首次对高F值寡肽进行研究，随后许多研究者也对高F值寡肽的抗疲劳，抗缺氧等活性进行了研究［4－5］。由于具有高F值，高F值寡肽可以通过纠正血浆及脑中的氨基酸病态模式治疗肝性脑病，但高F值寡肽对其他肝脏疾病的辅助治疗作用可能与其他作用机制相关。研究［6］显示，氧化应激在肝脏损伤、癌症、炎症及衰老等多种病理生理变化方面扮演着重要角色。因此，物质的抗氧化及清除自由基的作用与其生理功能存在密切关系，而活性肽的生理活性与其抗氧化性同样存在密切的关系［7］。本试验将研究马氏珠母贝高F值寡肽的体外抗氧化作用及其对H2O2诱导L02肝细胞损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料

马氏珠母贝高F值寡肽制品（PHFP）：根据文献［8］制备，F值达到24.58，分子量分布在150～1 000Da；

DPPH（sigma）、脱氧核糖（Fluka）：北京华美生物技术有限公司；

L02正常肝细胞：上海细胞库；

RPM I－1640培养基（GIBCO）、新鲜牛血清（杭州四季清）、双抗（GIBCO）、0.25% 胰蛋白酶 （含 0.05%EDTA）（GIBCO）、MTT（Americo）、VC：广州威佳生物技术有限公司；

15AA肝安注射液：广东彼迪药业有限公司；

其它试剂均为国产分析纯。

1.2 试剂与仪器

紫外可见分光光度计：UV－2102，尤尼柯（上海）仪器有限公司；

CO2培养箱：RCO3000T－5－VBC，美国热电集团公司；

倒置显微镜：CKX41－A32P，日本Olympus公司；

低速台式离心机：TDL－5－A，上海安亭科学仪器厂；

超低温冰箱：ULT1386－3－V40，美国热电集团公司；

全波 段 酶 标 仪：Bio－Tek HQuart，美 国 Bio－Tek 仪 器公司；

超声细胞处理器：FS－150，宁波新蓝生物科技股份有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 清除·OH自由基的能力评价（TBA法） 根据文献［9］，将PHFP样品于4℃下保存，所有的样品及缓冲液均采用微孔过滤膜过滤。将样品溶液0.5mL加入0.7mL的反应混合溶液中（20mmol/L的脱氧核糖0.5mL和10mmol/L的FeSO4－EDTA 0.2mL）混合溶液，采用磷酸盐缓冲液（pH 7.4，20mmol/L）将反应混合溶液稀释到1.8mL，然后，再加入10mmol/L的H2O20.2mL。随后，将此混合物于37℃下保存1h。最后，加入2.8%三氯醋酸（TCA）1mL终止反应，再加入1.0% （m/m）硫代巴比妥酸（TBA）溶液1.0 mL，在100℃下煮沸15min，于532nm波长下测定吸光值As，空白（不加样品溶液为空白）也于532nm下测定吸光值A0。样品对·OH自由基的清除率R1按式（1）计算：

方晓倩依然在高速路口等着他，他每次都说别跑这么远来等，让他不放心，她说:“时间那么少，多一秒是一秒。”他便不敢再说话。

1.3.2 清除DPPH·自由基能力评价 根据文献［9］，将1.5mL DPPH·溶液（0.1mmol/L，溶于95% 乙醇）置于试管中，加入1.5mL待测液，振荡混匀，室温放置45min后，在517nm处测定其吸光值（Ai），空白为1.5mL 95% 的乙醇加入1.5mL蒸馏水调零，对照为1.5mL DPPH·溶液加上1.5mL蒸馏水在517nm处的吸光值（Ac），样品在测定波长的吸光值为Aj。样品对DPPH·的清除率R2按式（2）计算：

1.3.3 清除O－2·自由基的能力评价（邻苯三酚自氧化法） 根据文献［9］，采用 Marklund法，向pH 8.2，2.8mL的Tris－HCl缓冲液（50mmol/L）中加入0.1mL待测样品（空白为等量去离子水），于25℃ 保温10min，然后加入0.1mL 25℃ 预温的邻苯三酚（60mmol/L）至总体积3.0mL（空白以等量10mmol/L的HCl代替），迅速摇匀，倒入1cm比色杯中，在420nm处，每隔半分钟测定一次吸光值A值，线性时间为4min，根据邻苯三酚自氧化速率计算抑制率（控制邻苯三酚的自氧化速率为0.050～0.065OD/min）。样品对O－2·的抑制率R3按式（3）计算：

式中：

ΔA420/ΔT（V0）—— 邻苯三酚自氧化速率，OD/min；

ΔA420/ΔT（V）—— 添加抗氧化剂的样液氧化速率，OD/min。

1.3.4 L02肝细胞培养及H2O2损伤模型的建立 将处于生长状态良好的肝细胞采用0.25%胰蛋白酶（含0.05%EDTA）消化后，RPMI－1640培养液调整细胞密度为1×105个/mL，将上述肝细胞悬液加入96孔培养板中，每孔100μL，置37℃，5%CO2培养箱中培养16h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。以H2O2为原液，以含10%小牛血清的 RPM I－1640为培养液，稀释配成含0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mmo1/L 的 H2O21640培养液。吸出原培养液，将上述培养液加入96孔培养板中，以无H2O2的1640培养液为空白对照。每个浓度做4个平行孔，损伤培养12h后，以MTT法测肝细胞存活率，确定H2O2损伤浓度。当H2O2损伤浓度确定后，同样方法确定损伤培养时间，建立L02正常肝细胞的H2O2损伤模型。

1.3.5 高F值寡肽对H2O2诱导L02肝细胞损伤的保护作用 调整细胞密度为1×105个/mL，将肝细胞悬液加入96孔和6孔培养板中，置37℃，5%CO2培养箱中培养16h后，肝细胞全部贴壁生长，供试验用。设a.对照组：培养液常规培养，不加处理因素；b.H2O2模型组：培养液加入确定浓度的 H2O2；c.高F值寡肽预处理组：含浓度为500，1 000，1 500μg/mL PHFP的培养液预孵育8h后，加入确定浓度的H2O2继续培养一定时间。d.阳性对照肝安组：含浓度为500μg/mL 15AA的培养液预孵育8h后，加入确定浓度的H2O2继续培养一定时间；e.阳性对照维生素C组：含浓度为500μg/mL VC预孵育8h后，加入确定浓度的H2O2继续培养一定时间。每组至少设4个复孔。MTT比色法测定96孔板肝细胞的存活率。

MTT比色法：待测96孔培养板各孔加入20μL MTT试剂（5mg/mL，临用前PBS溶解配制，0.22μm滤膜过滤除菌），轻轻混匀，继续37℃培养4h，然后向各孔加入100μL三联液，继续37℃保温过夜，酶标仪570nm比色。细胞存活率按式（4）计算：

1.3.6 数据统计分析 细胞试验各组数据均依X±S表示，组间均数进行t检验，采用SPSS 11.0软件包进行统计分析。

2 结果与讨论

2.1 高F值寡肽在化学反应体系中清除自由基的活性

本试验利用Fenton反应产生·OH并攻击α－脱氧核糖［10］，使其产生丙二醛后利用TBARS法进行测定。如果反应体系中存在自由基清除剂，即可减轻因受到·OH自由基的攻击而发生α－脱氧核糖的氧化。图1比较了酶解液、高F值寡肽、肝安及VC对·OH自由基的清除活性，4种样品均表现具有一定的·OH自由基清除活性，并且随着浓度的增加，清除能力也逐渐增强，表现出剂量相关性，在样品浓度＜5mg/mL范围内，剂量相关性较明显，当样品浓度＞5mg/mL后，随着浓度的增加，·OH自由基清除效果增加缓慢。并且，从图1可看出，马氏珠母贝高F值寡肽的清除效果最好，当浓度达到10mg/mL时候，清除率达到了60.8%。

图1 清除·OH自由基活性Figure 1 The scavenging abilities on·OH

DPPH·是一个大分子的稳定自由基，被广泛用于自由基清除剂的筛选［11］。图2列出了酶解液、马氏珠母贝高F值寡肽、肝安及VC对DPPH· 的清除活性，由图2可知，4种样品均表现出清除DPPH·活性，并且随着浓度的增加，清除能力也逐渐增强，表现出剂量相关性，在样品浓度＜3mg/mL范围内，剂量相关性较明显，而当样品浓度＞3mg/mL后，随着浓度的增加，DPPH·清除效果增加趋势较缓慢。并且，从图2可以看出，阳性对照VC清除DPPH·自由基的能力最强，在浓度为0.5mg/mL时，DPPH·自由基的清除能力就达到了71.3%。而马氏珠母贝高F值寡肽清除DPPH·自由基能力与15AA相近，剂量关系曲线也较相似，在浓度为10mg/mL时，DPPH·自由基的清除能力达到了50.8%。

图2 清除·DPPH自由基活性Figure 2 The scavenging abilities on·DPPH

O－2·的形成是氧毒性的主要因素，癌症患者化疗时，可诱发自由基O－2·的大量产生，引起骨髓损伤、白血球减少等严重的副作用［12］。图3列出了酶解液、马氏珠母贝高F值寡肽、肝安及VC对O－2·的清除活性。由图3可知，VC清除O－2·自由基的能力最强，在浓度为3mg/mL时，O－2·自由基清除能力就已经达到96.8%，而当浓度＞3mg/mL时，VC对O－2·自由基的清除率达到100%。4种样品中，高F值寡肽清除O－2·自由基的能力比15AA和酶解液高，并且随着浓度的增大呈剂量相关性。

图3 清除O－2·自由基活性Figure 3 The scavenging abilities on O－2·

综合比较马氏珠母贝高F值寡肽对不同自由基的清除能力可以发现，马氏珠母贝高F值寡肽对自由基DPPH·、·OH和O－2·的清除效果完全不同，提示马氏珠母贝高F值寡肽可能有着不同的抗氧化机制。3种自由基中，马氏珠母贝高F值寡肽对·OH自由基的清除效果最好，·OH自由基是进攻最强的化学物质之一，一旦·OH自由基与物质接触，在接触瞬间即可完成对物质的攻击。马氏珠母贝高F值寡肽可能就是通过有效抑制了Fenton反应后·OH的产生而达到抗氧化效果。并且，马氏珠母贝高F值寡肽对3种自由基的清除效果均好于常用肝性脑病治疗药物肝安注射液，这为进一步开发更有效的治疗肝脏疾病药物提供了理论基础。

2.2 高F值寡肽对H2O2诱导L02肝细胞损伤的保护作用

2.2.1 H2O2损伤L02肝细胞模型的建立 为较好地显示H2O2诱导肝细胞损伤与保护因子作用的差异，损伤后细胞存活率最好在30%～70%之间，并且为了更科学计算半数至死剂量LD50及试验的科学性，对H2O2损伤L02肝细胞建模。由图4～5结果可看出，选择H2O2的作用浓度为0.4，0.6，0.8mmol/L，作用时间为8h。

图4 不同浓度H2O2损伤后L02肝细胞的存活率Figure 4 The L02cell viability after injury induced by H2O2

2.2.2 肝细胞损伤存活率的影响 表1显示了马氏珠母贝高F值寡肽对不同浓度H2O2诱导L02肝细胞损伤的保护作用。由表1结果可以看出：马氏珠母贝高F值寡肽具有一定的抗H2O2损伤L02肝细胞的作用，在低剂量浓度时（500μg/mL），这种保护作用较不明显，在中、高剂量浓度（1 000，1 500μg/mL）时，效果较好。在经过马氏珠母贝高F值寡肽保护处理后，H2O2对L02肝细胞的半数致死剂量LD50由原来的0.618mmol/L提高到0.737和0.734mmol/L，分别提高了19.3%和18.8%。而阳性对照15AA和VC也均起到了一定的抗H2O2损伤L02肝细胞作用，半数致死剂量LD50分别提高到0.768和0.744mmol/L，提高了24.3%和20.4%。而酶解液处理后，LD50提高到0.688，也提高了11.3%，这可能是由于酶解液中含有一定量的牛磺酸，牛磺酸对肝细胞损伤具有一定的保护作用［13］。

图5 L02肝细胞H2O2损伤时间的确定Figure 5 The effect of injured time on the L02cell viability

表1 马氏珠母贝高F值寡肽对H2O2损伤L02肝细胞保护作用ńTable 1 The effect of PHFP on the L02 cells injury induced by H2O2

3 结论

在化学反应体系中，马氏珠母贝高F值寡肽对·OH、DPPH·及O－2·均具有一定的清除能力。在浓度为10mg/mL时，对3种自由基的清除率分别达到了60.8%、50.8%和44.2%。马氏珠母贝高F值寡肽对H2O2诱导L02肝细胞损伤具有一定保护作用，剂量为1mg/mL的马氏珠母贝高F值寡肽使H2O2诱导损伤L02肝细胞的半数致死剂量LD50由损伤模型组的0.618提高到0.737，提高了19.3%。

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Preliminary study on the antioxidant activity and protective effects on L02 cell injury ofpinctada martensiihigh fischer ratio oligopeptides

ZHENG Hui－na1，2ZHANG Chao－hua1，2JI Hong－wu1，2QIN Xiao－ming1，2

（1.Key Laboratory of Aquatic Product Advanced Processing of Guangdong Higher Education Institutes，Zhanjiang，Guangdong524088，China；2.College of Food Science＆ Technology，Guangdong Ocean University，Zhanjiang，Guangdong524088，China）

The free radical scavenging activity of PHFP and the protective effects of PHFP on L02cells injury induced by H2O2were studied.The results indicated that in chemical reaction system，the scavenging ability of PHFP（10mg/mL）for three kind of free radical·OH、DPPH·and O－2·was 60.8%，50.8%and 44.2%respectively.And when the L02cells were treated with 1mg/mL PHFP，theLD50of H2O2changed from 0.618mmol/L to 0.737mmol/L，increased by 19.3%.

pinctada martensii；high fischer’ratio oligopeptides；antioxidant activity

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

国家科技支撑计划课题（编号：2007BAD29B09）；现代农业产业技术体系建设专项资金资助（编号：贝类，47）；广东海洋大学引进人才基金（编号：0912259）

郑惠娜（1979－），女，广东海洋大学讲师，博士。E－mail：margaretphd＠126.com

章超桦

2010－08－01