防腐剂复配优化抗藤黄微球菌研究

黄现青高晓平赵改名

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002；3.双汇集团技术中心，河南 漯河 462003）

防腐剂复配优化抗藤黄微球菌研究

黄现青1，2，3高晓平1，2赵改名1，2

（1.河南农业大学食品科学技术学院，河南 郑州 450002；2.河南省肉制品加工与质量安全控制重点实验室，河南 郑州 450002；3.双汇集团技术中心，河南 漯河 462003）

选择不同的防腐剂，通过药敏纸片法、最小抑菌浓度（MIC）法测定藤黄微球菌对其敏感性，利用正交设计筛选最佳防腐剂组合，并对获得的最佳防腐剂组合抑菌效果进行验证。结果表明，藤黄微球菌对Nisin、聚赖氨酸、尼泊金乙酯较为敏感，MIC分别为0.078，0.039，0.125mg/mL。当 Nisin、聚赖氨酸和尼泊金乙酯浓度分别为 0.313，0.156，0.125mg/mL时，组合抑菌效果最佳，可使基质中藤黄微球菌降低2.7个数量级以上。选择这一最佳组合在25℃和0～4℃条件下，可显著抑制牛乳、里脊肉、猕猴桃果汁中藤黄微球菌的增殖。

防腐剂；藤黄微球菌；抑菌

藤黄微球菌广泛分布于空气、水、土壤中，是寄生于人体皮肤、咽部、眼睛等对人体无害的腐生菌，但机体抵抗力下降时，仍可引起各种感染，属于条件致病菌［1］。近年来在抗生素选择压力下，条件致病菌日益增多，并且有继续增高的趋势［2］，因此对藤黄微球菌应引起高度的重视［3］。此外，由于抗性的增强，相应的也导致了其污染食品的机率，必须前瞻性的构建食品中藤黄微球菌的控制技术。

乳酸链球菌素（Nisin）、聚赖氨酸、山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯均是食品中常用的防腐剂，但是抑菌特点不同［4］，鲜见关于复配防腐剂抑制藤黄微球菌效果的研究。鉴于藤黄微球菌对食品安全的威胁，以及复配可降低单一防腐剂过量使用的风险，本试验用Nisin、聚赖氨酸、山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯5种防腐剂来对藤黄微球菌的抑菌效果加以研究，并对防腐剂的最佳配比进行优化，旨在为商业应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料

Nisin、聚赖氨酸、山梨酸钾、乳酸钠、尼泊金乙酯：浙江银象生物工程有限公司；

牛肉浸膏、蛋白胨：北京双旋WSW培养基制品厂；

平板计数琼脂：北京奥博星生物技术有限责任公司；

藤黄微球菌标准株：中科院微生物所。

1.1.2 主要仪器

酶标仪：GF－M2000型，山东高密彩虹分析仪器有限公司；

高速冷冻离心机：GTR10－1型，北京时代北利离心机有限公司；

超净工作台：JB－CJ－2FD型，苏州佳宝净化工程设备有限公司；

电热恒温培养箱：DNP型，金坛市国旺实验仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 培养基的配制 LB液体培养基（牛肉膏0.5%、蛋白胨1%、氯化钠0.5%、pH 7.2～7.4）、LB固体培养基（在 LB液体培养基中加入1.5%琼脂粉）、平板菌落计数琼脂（称取23.5g加入到1L蒸馏水中加热煮沸溶解后分装），均于121℃ 灭菌15min，冷却后备用。

1.2.2 细菌培养 取冰箱斜面保存藤黄微球菌活化后，接种到装有100mL LB液体培养基的250mL三角瓶中，接种3瓶，于37℃恒温摇床（120r/min）培养18h后，1瓶用于敏感性测定，另外2瓶在无菌条件下进行以下操作：3 000r/min离心15min收获菌体；然后用50mL无菌生理盐水悬浮，3 000r/min离心15min，收获菌体；无菌生理盐水漂洗重复3次后，再用无菌生理盐水漂洗悬浮菌体，使细菌细胞浓度在105CFU/mL左右，备用。

1.2.3 敏感性测定 敏感性测定分别采用药敏纸片法和最小抑菌浓度法（MIC），参照文献［5］进行。

1.2.4 正交试验设计 选取3种敏感性较高的防腐剂为试验因子，以MIC值和食品最大添加量为参考选择3水平，设计3因素3水平正交试验。具体操作步骤为：首先按照试验设计将复合防腐剂配制好，各取1mL分别装入无菌试管中；然后各加入1.2.2制备的无菌生理盐水悬浮菌液1mL，同时设立不添加防腐剂的空白对照，均于25℃条件下处理6h后，通过菌落平板计数法测定残留存活藤黄微球菌细菌数量，评价防腐剂的抑菌效果，筛选最优防腐剂复配组合。

1.2.5 应用试验 以肉、乳、果汁为基质，每100g各加入1.2.2培养后的藤黄微球菌1mL，然后加入经正交试验优化后的复配防腐剂1mL。把样品分别于25℃、0～4℃放置不同时间后，通过平板菌落计数法测定残留存活细菌总数，研究其在不同食品介质中的防腐效果。

1.3 菌落计数

菌落总数的测定按照 GB/T 4789.2——2010，采用平板倾注法［6］。

2 结果与分析

2.1 敏感性测定结果

利用药敏纸片法测定不同防腐剂对藤黄微球菌抑菌圈的大小，确定藤黄微球菌对不同防腐剂的敏感性，试验结果见表1。

表1 抑菌圈直径ńTable 1 Inhibition zone diameter /mm

由表1可知，Nisin、聚赖氨酸、尼泊金乙酯对藤黄微球菌有抑菌作用，在浓度为20mg/mL时抑菌圈直径分别是11，10.5，7mm。

以96孔微量酶标板测定 MIC，利用GF－M2000酶标仪在492nm处测定吸光度值。结果表明，Nisin、聚赖氨酸、尼泊金乙酯的 MIC分别为0.078，0.039，0.25mg/mL。

2.2 正交试验结果

参照各种防腐剂在食品中的应用限量以及其MIC值，考虑协同作用及减少防腐剂在食品中的添加量，设计防腐剂的水平，进行正交试验设计（见表2）。表2中A/B两个因子的水平是参照MIC值，在考虑了其食品添加限量的基础上，以4倍比的梯度设立的，旨在能获得最佳的抑菌效果。正交试验结果及分析见表3。由表3可知，3种防腐剂抑菌性由强至弱依次为Nisin＞聚赖氨酸＞尼泊金乙酯，最优组合为Nisin 0.313mg/mL、聚赖氨酸0.156mg/mL、尼泊金乙酯0.125mg/mL。经验证实验（见表4）证明在此最优组合条件下，可显著的抑制或杀灭藤黄微球菌。

表2 正交试验因素与水平Table 2 Orthogonal factors and the level/（mg·mL－1）

2.3 应用试验

室温（25℃）及0～4℃处理3种样品菌落计数结果见表5。由表5可知，3种样品加入最佳复配防腐剂后，在室温条件下可有效地减缓细菌的增殖。猕猴桃汁、里脊肉、牛乳中细菌数在经过4d放置后，仅仅分别增长3.14、2.85、0.67个数量级，显著的低于没有添加防腐剂的对照组。同样的在0～4℃ 条件下，复配防腐剂抑菌效果更加明显，猕猴桃汁、里脊肉和牛乳在放置5d后分别降低了1.3、0.6、1.3个数量级，而没有添加防腐剂的对照组细菌数均有明显的增加。3种样品的腐败速度以牛乳最快，而猕猴桃最慢，可能与猕猴桃中含有丰富的VC、果酸等成分，具有防腐效果有关［7］。

表3 正交试验结果及分析Table 3 Orthogonal test results

表4 验证试验Table 4 Test validate

通过表5还可以看出，复配防腐剂在低温条件下抑菌效果较好。这是因为在室温条件下，细菌增殖较快，同时由于食品介质的影响，防腐剂抑菌效果会有所减弱。而在低温条件下，细菌生长繁殖基本停止，复配防腐剂可表现出较好的抑菌效果，甚至具有一定的杀菌效果。

3 结论

研究结果表明Nisin、聚赖氨酸和尼泊金乙酯对藤黄微球菌具有明显的抑菌效果。当其浓度为20mg/mL时，抑菌圈直径分别为11，10.5，7mm；利用96微孔板法测得其 MIC分别为0.078，0.039，0.125mg/mL；通过正交试验获得其最佳复配比例为：乳酸链球菌0.313mg/mL、聚赖氨酸0.156mg/mL和尼泊金乙酯0.125mg/mL，在此复配比例下，可使基质中藤黄微球菌降低2.7个数量级以上。

表5 食品介质应用试验结果ńTable 5 Application test results of different food medium /（CFU·mL－1）

通过在不同食品介质中验证性实验，表明在25℃贮藏时可以有效抑制细菌的增殖，可保障猕猴桃汁、里脊肉、牛乳在经过4d放置后，细菌总数仅仅分别增长3.14、2.85、0.67个数量级。而在0～4℃放置时3种样品中细菌总数都显著减少，贮藏5d后分别降低了1.3、0.6、1.3个数量级。通过系统研究，获得了有效的防腐剂复配组合，为其在食品中的应用提供了理论依据。

复配可降低单一防腐剂的用量，也是本试验的主要目的之一。单一防腐剂的MIC却明显低于复配中剂量的原因为：由于测定MIC使用的是LB液体培养基，对防腐剂抑菌效果影响极小，而在食品介质中成分较为复杂，微生物种类较多，对防腐剂的抑菌效果影响较大，所以优化试验以MIC值为基数，按照倍比的方法设计的试验梯度（同时也考虑到了各种防腐剂在食品中的添加限量）。虽然看复配防腐剂浓度比MIC值高出很多，但是还是比食品中防腐剂添加剂量有较大的降低。

1 宗淑杰，吴明江，秦银河，等.医家金鉴·检验医学卷（下）［M］.北京：军事医学科学出版社，2007：300.

2 曾锋，张立彦，曾庆孝.微生物对食品防腐剂的抗药性研究进展［J］.食品与机械，2005，21（2）：51～53.

3 姜梅杰，魏绪廷.颅脑外伤患者脑脊液中检出藤黄微球菌一例［J］.中华神经外科杂志，2005，21（12）：735.

4 张鹰，曾新安，温其标.生物防腐剂及其在食品中的应用［J］.食品与机械，2006，22（1）：77～79.

5 黄现青，别小妹，吕凤霞，等.枯草芽孢杆菌fmbJ产脂肽抑制点青霉效果及其桃防腐试验［J］.农业工程学报，2008，24（1）：263～267.

6 中华人民共和国卫生部.GB/T4789.2——2010食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定［S］.北京：中国标准出版社，2010.

7 徐幸莲，彭增起，邓桑贵.食品原料学［M］.北京：中国计量出版社，2006：116～120.

Study on sterilization of optimization of preservative combination againstmicrococcus luteus

HUANG Xian－Qing1，2，3GAO Xiao－Ping1，2ZHAO Gai－Ming1，2

（1.College of Food Science and Technology，Henan Agricultural University，Zhengzhou，Henan450002，China；2.Henan Key Laboratory of Meat Processing and Quality Safety Control，Zhengzhou，Henan450002，China；3.Technology Center of Shineway Group，Luohe，Henan462003，China）

The inhibitive effect onmicrococcus luteusthrough the determination of the sensitivity，minimum inhibitory concentration （MIC），orthogonal experimental optimization and application effect experiment with different preservative were studied in the paper.The results showed thatmicrococcus luteusare are sensitive to nisin，ε－polylysine and ethylparaben with MIC 0.078mg/mL，0.039mg/mL，0.125mg/mL respectively.The sterilization effect onmicrococcus luteuswas best when concentrations of the nisin，ε－polylysine and ethylparaben were 0.313mg/mL，0.156mg/mL，0.125mg/mL respectively，the bactericidal effect was best combination conditions，and depress 2.7orders ofmicrococcus luteusin food medium.That could significantly inhibitmicrococcus luteusmultiplication in the milk，meat，syrup of Chinese goosebeery when select the best preservative combination at 25℃and at 0～4℃.

preservative；micrococcus luteus；inhibition

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

公益性行业（农业）科研专项经费项目（编号：200903012）；河南省基础与前沿技术研究计划项目（编号：082300430050）

黄现青（1977－），男，河南农业大学副教授，博士。E－mial：hxq8210＠126.com

赵改名

2010－06－01