沙棘生物活性肽的制备及功效研究

黄 鹏苏 宁王昌涛

（1.北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100025；3.东北农业大学生命学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

沙棘生物活性肽的制备及功效研究

黄 鹏1，3苏 宁2王昌涛1

（1.北京工商大学植物资源研究开发北京市重点实验室，北京 100048；2.中国检验检疫科学研究院，北京 100025；3.东北农业大学生命学院，黑龙江 哈尔滨 150030）

以沙棘粕为原料，制备生物活性肽；以多肽提取率为响应值，通过正交试验，研究最佳的酶解工艺；并探讨酶解液多肽粗提物的抗氧化及酪氨酸酶抑制率。结果表明：沙棘粕酶解制备多肽的最优条件为加酶量3%、液料比15∶1（V∶m）、酶解反应时间1h；5mg/mL粗提物对DPPH清除率为68%，酪氨酸酶抑制率为76%。

沙棘；酶解；正交试验；功效研究

沙棘果是一种含有多种生物活性物质的药用食物。前苏联学者发现其果实中含有黄酮和酚类36种［1］。沙棘种子分离出来的蛋白质有13种氨基酸，其中包括人体不能合成的8种必需氨基酸，尚含有大量的非蛋白氮［2］，氨基酸总量约占11%［3］。目前关于沙棘有效成分提取的研究开发主要集中在黄酮类物质、沙棘油、花青素等方面，对沙棘蛋白提取报道相对较少，而且现有报道［4－5］多采用碱溶酸沉法提取，但该法容易造成蛋白质变性失活。

本试验以沙棘粕为原料，采用蛋白酶法酶解制备植物生物活性肽，并对粗提液的抗氧化活性进行研究。

1 材料与方法

1.1 材料

沙棘粕：沙棘籽提油后的剩余物，青海康普生物技术股份有限公司提供；

Neutrase、Alcalase、Flavourzyme、Protamex蛋白酶：诺维信酶制剂公司；

NG蛋白酶：日本天野公司。

1.2 仪器与试剂

pH计：PHS－3D，上海三信仪表厂；

离心机：SIGMA 3－18K，美国Sigma公司；

数显恒温水浴锅：HH－1，国华电器有限公司；

多用途水浴恒温振荡：DSHZ－300，江苏太仓市实验设备厂；

紫外可见分光光度计：T6新悦，北京普析通用仪器有限公司。

1.3 多肽粗提物的制备

称取粉碎后的沙棘粕（经50目过筛）10g，按一定液料比进行混合，将样品液置于水浴恒温振荡器预处理1h，加入一定比例的蛋白酶，再次将溶液置于水浴恒温振荡器预处理，反应一定时间后，在80℃的恒温水浴锅中灭酶10min，然后在4 000r/min的条件下离心10min，提取上清液（测量多肽含量，计算多肽提取率）。将获得的上清液旋转蒸发至适当体积后低温冷冻干燥得多肽粗提物。

1.4 试验方法

1.4.1 蛋白酶种类的选择 根据表1蛋白酶活力，加入相同活力的各种蛋白酶对沙棘粕进行酶解，酶解条件为：加酶量3%、酶解温度45℃，液料比10∶1（V∶m），按1.3制备酶解液，并测定各酶解液中多肽的含量。预试验结果表明，Neutrase酶对沙棘粕蛋白的酶解效果最佳。故本试验选择Neutrase酶对沙棘粕蛋白进行酶解。

表1 蛋白酶活力Table 1 Protease activity

1.4.2 酶解工艺条件的单因素试验设计 根据预试验结果，确定酶解条件为：加酶量3%、酶解温度45℃，液料比10∶1（V∶m），然后分别变动其中的某个参数：蛋白酶添加量分别为1%、3%、5%、7%、9%；液料比分别为5∶1、10∶1、15∶1、20∶1、25∶1（V∶m）；酶解时间分别为1，2，3，4，5h按1.3步骤进行酶解试验，测定多肽的含量，并计算提取率。

1.4.3 正交试验方法 根据单因素试验结果进行正交试验，以确定最优化酶解工艺条件参数。

1.4.4 功效研究 以沙棘活性多肽正交试验所获得的最佳条件进行提取，测定不同浓度多肽粗提物的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制率。

1.5 检测方法

1.5.1 多肽含量的测定 采用Folin－酚测定多肽含量。回归方程：y＝0.002 7x＋0.041 5，R2＝0.996 9。y：吸光度值，x：蛋白质含量（μg/mL）。

1.5.2 蛋白酶活力的测定 采用 QB/T1803——1993蛋白酶活力的测定方法。以酪蛋白为标样，制作标准曲线。回归方程：y＝0.009 7x＋0.026 7，R2＝0.998 6。y：吸光度值，x：蛋白酶活力。

1.5.3 抗氧化活性测定 采用DPPH法［6］。在试管内依次加入乙醇、DPPH、待测液，混匀，30min后在517nm处测吸光度，记为A；乙醇代替DPPH的测定值记为A1；蒸馏水代替待测品的测定值记为A0。DPPH自由基的清除率按式（1）计算：

式中：

K——对DPPH自由基的清除率，%；

A0——空白的吸光度值；

A——样品的吸光度值；

A1——乙醇的吸光度值。

1.5.4 沙棘粕多肽提取率的计算 沙棘粕多肽提取率按式（2）计算：

2 结果与分析

2.1 酶解工艺条件的正交试验

根据单因素试验结果，设立正交试验因素水平表见表2，正交试验结果及分析见表3。

表2 正交试验因素水平Table 2 The level of orthogonal factors

表3 正交试验结果及分析Table 3 The results and analysis of rthogonal test

由表3可知，3个因素对沙棘粕多肽提取率的影响大小依次为B＞C＞A，其最佳制备工艺组合为A2B3C1，即加酶量3%、液料比为15∶1（V∶m）、在45℃条件下反应1h。按照该工艺条件进行3次验证实验，其多肽的平均提取率为4.48%，证明该工艺最优。

2.2 功效研究

2.2.1 抗氧化活性测定 采用DPPH法测定不同浓度粗提物的抗氧化活性，结果见图1。

由图1可知，样品浓度在1mg/mL到3mg/mL变化时，DPPH清除率随着浓度的增加增幅较大，3mg/mL以后增幅较小。样品浓度为5mg/mL时DPPH清除率为68%。由此可见，所制得的粗提物具有较好的抗氧化活性。

图1 样品浓度对DPPH清除率的影响Figure 1 Effect of sample concentration on clearance rate of DPPH

图2 样品浓度对酪氨酸酶抑制率的影响Figure 2 Effect of Sample concentration on tyrosinase inhibition rate

2.2.2 酪氨酸酶抑制作用 样品浓度对酪氨酸酶抑制率的影响见图2。

由图2可知，随着样品浓度的增加，酪氨酸酶的抑制率也随之增加。当样品浓度由2mg/mL到4mg/mL时，酪氨酸酶抑制率变化最明显，之后抑制率趋于平缓。5mg/mL时抑制率达76%。

3 结论

酶解沙棘粕制备生物活性多肽的最优提取条件为：加酶量3%，液料比15∶1（V∶m），酶解时间分别为1h。该条件下多肽提取率可达4.58%。沙棘活性多肽粗提取物有较高的抗氧化活性和酪氨酸酶抑制率，具有较大的开发前景。

1 张哲民.苏联沙棘油研究利用的进展与对策［J］.沙棘，1990（3）：42～46.

2 葛孝炎，史国富，马翠英.沙棘化学成分的研究概况［J］.中草药，1986，17（8）：42～44.

3 金怡，姚敏.沙棘的研究概况［J］.中医药信息，2003，20（3）：21～22.

4 赵晨伟.沙棘分离蛋白提取工艺研究［J］.食品科技，2009，16（6）：33～35.

5 张文博，库尔班江，张焱.新疆野生沙棘种仁蛋白的提取和氨基酸分析［J］.粮油加工，2008（8）：56～58.

6 Nikolaos Nenadis，Maria Tsimidou.Observations on the estimation of scavenging activity of phenolic compounds using rapid 1，1－diphenyl－2－picrylhydrazyl（DPPH·）tests［J］.JAOCS，2002，79（12）：1 191～1 195.

Study on preparation and efficacy of sea buckthorn polypeptide

HUANG Peng1，3SU Ning2WANG Chang－tao1

（1.Beijing Technology and Business University，Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing100048，China；2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine，Beijing100025，China；3.College of Life Sciences，Northeast Agricultural University，Harbin，Heilongjiang150030，China）

Take sea buckthorn meal as raw material，and bioactive polypeptide is prepared.The degree of polypeptide content were used as response values .The optimum extracting condition was determined in process.Finally，anti－oxidation and tyrosinase inhibition rate were been discussed.The results show that the optimum conditions of preparation of bioactive polypeptide are enzyme concentration：3%，water feed ratio 15，time of 1h.Anti－oxidation and tyrosinase inhibition rates of 5mg/ml crude extracts were 68%and 76%.

sea buckthorn；protease；orthogonal experiment；efficacy

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

北京市科技新星项目（编号：2008B08）

黄鹏（1984－），男，东北农业大学生命技术学院在读硕士研究生。E－mail：huangpeng0815＠sina.com

王昌涛

2010－07－11