诃子中活性物质的提取及其抗氧化、抑菌作用研究

王 双王昌涛都晓伟

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.北京工商大学植物资源研究开发重点实验室，北京 100048）

诃子中活性物质的提取及其抗氧化、抑菌作用研究

王 双1王昌涛2都晓伟1

（1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040；2.北京工商大学植物资源研究开发重点实验室，北京 100048）

利用微波法提取诃子中抗氧化活性物质。以抗氧化活性为指标，采用响应面法研究温度、时间、料液比对产物抗氧化活性的影响。在温度53.6℃，时间3min，料液比1∶19（m∶V）的条件下，产物抗氧化活性即Trolox浓度为63 081μmol/L。产物对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子具有清除作用，其IC50值分别为0.44，1.01，0.64mg/mL，产物对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌有抑制作用，而对黑曲霉无抑制作用。

微波；诃子；抗氧化；功效

诃子 （terminalia chebula retz.）为使君子科榄仁树属植物诃子及其变种绒毛诃子的干燥成熟果实，是藏族习用药材，被誉为“藏药之王”［1］。诃子原产于印度、缅甸等地，在中国云南、广东、广西等地也有分布。诃子的主要成分为鞣质和多元酚，它们可以终止自由基的连锁反应，具有抗氧化活性［2－8］。微波提取法是一种新型的提取技术，它具有选择性高、提取时间短、加热效率高、质量好、安全无污染的特点［9］。迄今未见到微波法提取诃子成分的相关报道，本试验采用微波提取技术从诃子中获得抗氧化活性物质，并对提取物进行抗氧化活性及抑菌作用的功效研究。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 试剂

诃子：北京同仁堂药店；

无水乙醇、30%过氧化氢：分析纯，北京化工厂；

甲醇：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；

DPPH、Trolox：纯度≥98%，德国Sigma公司；

氯化硝基四氮唑蓝（NBT）、番红花红、核黄素、EDTA－2Na、蛋氨酸：纯度≥98%，国药集团化学试剂有限公司；

硫酸亚铁：分析纯，天津市天大化工实验厂。

1.1.2 主要仪器

离心机：3－18K，德国Sigma公司；

紫外可见分光光度计：T6，北京普析通用仪器有限责任公司；

数显恒温水浴锅：HH－1，国华电器有限公司；

电热恒温鼓风干燥箱：DHG－9030A，上海精宏实验设备有限公司；

电子天平：DENVER，北京赛多利斯仪器系列有限公司；

微波仪：MARS5，培安CEM微波化学（中国）技术中心。

1.2 试验方法

1.2.1 Trolox标准曲线的绘制 称取12.5mg DPPH溶解于甲醇中，再定容至100mL，使用时稀释5倍至25mg/L。称取Trolox标准品适量，用乙醇分别配制为0，200，400，600，800，1 000μM 的标准品溶液，然后吸取0.1mL不同浓度的标准品溶液，分别加入3.9mL DPPH甲醇溶液，在黑暗处反应20min后于515nm处测定吸光度A，用甲醇调零［10］。根据试验结果，绘制以吸光度A为Y轴和Trolox浓度（μmol/L）为X轴的标准曲线，结果见图1。测定样品溶液的Trolox浓度时，所得结果乘以溶液稀释倍数。

图1 Trolox标准曲线Figure 1 Trolox standard curve

1.2.2 微波法提取抗氧化活性物质的工艺及单因素试验

称取诃子粉末（过50目筛）适量，按照一定的料液比与提取溶剂混合，在一定温度下微波提取一定时间，提取液离心，取上清液稀释适当倍数，测得Trolox浓度。分别考察乙醇浓度、料液比、温度和时间4个单因素对抗氧化活性物质提取的影响，确定单因素的最佳条件，再根据单因素试验结果进行响应面试验，确定抗氧化活性物质的最佳提取工艺。

（1）乙醇浓度单因素试验：该试验变量为乙醇浓度，其分别设为30%、40%、50%、60%、70%，固定参数包括料液比1∶30（m∶V）、微波功率1 200W、温度60℃和时间3min，测定提取液的抗氧化能力。

（2）料液比单因素试验：该试验变量为料液比，其分别设为1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（m∶V），固定参数包括乙醇浓度50%、微波功率1 200W、温度60℃和时间3min，测定提取液的抗氧化能力。

（3）温度单因素试验：该试验变量为温度，其分别设为40，50，60，70，80 ℃，固定参数包括乙醇浓度50%、料液比1∶20（m∶V）、微波功率1 200W和时间3min，测定提取液的抗氧化能力。

（4）时间单因素试验：该试验变量为时间，其分别设为1，3，5，7，9min，固定参数包括乙醇浓度50%、料液比1∶20（m∶V）、微波功率1 200W和温度60℃，测定提取液的抗氧化能力。

1.2.3 DPPH自由基清除率的测定 采用DPPH 95%乙醇体系测定法［11］。

1.2.4 羟自由基清除率的测定 采用二价铁离子测定法［12］。

1.2.5 超氧阴离子自由基清除率的测定 采用光照核黄素测定法［12］。

1.2.6 抑菌试验 选择金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌、黑曲霉作为考察菌，分别使用最适培养基，采用滤纸片法，测量抑菌圈直径的大小作为抑菌物质生物效果评定的依据，抑菌圈直径≤6mm视为无抑菌作用［13］。

2 结果与分析

2.1 微波法提取抗氧化活性物质的单因素试验

单因素试验结果表明，随着乙醇浓度的增大，Trolox浓度呈先增后减的趋势，当乙醇浓度为50%时，Trolox浓度最大，即抗氧化活性物质提取效果最好；随着料液比的增大，Trolox浓度逐渐增大，当料液比为1∶20（m∶V）时曲线上升趋势趋于平缓，故料液比采用1∶20（m∶V）；随着温度的增高，Trolox浓度呈先增后减的趋势，当温度为60℃时Trolox浓度最大，即抗氧化活性物质的提取效果最好；随着时间的增加，Trolox浓度呈先增后减的趋势，当时间为3min时，Trolox浓度最大，即抗氧化活性物质的提取效果最好。

2.2 微波法提取抗氧化活性物质的响应面试验

2.2.1 响应面试验设计 根据单因素试验的结果，选择温度、时间、料液比3个单因素，设计3因素3水平的响应面试验，试验设计及结果见表1、2。

表1 响应面试验因素和水平Table 1 Factors and level of response surface experiment

表2 响应面试验结果Table 2 Response surface results

2.2.2 响应面方差分析 利用SAS软件对响应面试验结果进行方差分析，结果见表3。

表3 影响因素的方差分析Table 3 The factors affecting the variance analysis

由表3的方差分析结果可知：时间（X2）和料液比（X3）在试验过程中起主要作用，而温度（X1）相对来说作用小一些，即对微波提取法的影响效果：时间＞料液比＞温度。

2.2.3 响应面统计检验 利用SAS软件对响应面结果进行统计检验，结果见表4。

表4 模型的可信度分析的统计检验结果Table 4 The statistical analysis of the credibility of the model test results

由表4中复相关系数R2＝97.07%，说明方程的因变量与全体自变量之间的回归效果显著，可用于试验分析。

2.2.4 回归方程 利用SAS程序对响应值进行回归分析，经回归拟和后得到回归方程：

2.2.5 回归方程方差分析 利用SAS程序对回归方程进行方差分析，结果见表5。

表5 回归方程各项的方差分析ńTable 5 The regression equation of variance analysis

由表5可知，方差的一次项显著，二次项极其显著，说明各具体试验因素对响应值的影响不是简单的一次线性关系；交互项显著，因此各因素之间存在交互作用，在试验中的影响不可忽略。另外总回归项极其显著证明回归方程拟合程度较好，具有很高的可信性和准确性；失拟项不显著，说明试验的误差很小。

2.2.6 响应面曲面及等高线图 利用SAS软件得到响应面曲面及等高线图，见图2～4。

图2 温度和时间对Trolox浓度的响应曲面及等高线图Figure 2 Trolox concentration response surface on temperature and time

图3 温度和料液比对Trolox浓度的响应曲面及等高线图Figure 3 Trolox concentration response surface on temperature and solid to liquid ratio

通过响应面试验结果进行分析，由模型求偏导计算得出最佳提取工艺的反应条件为：温度为53.6℃，时间为3min，料液比为1∶19（m∶V）。为了验证响应条件的正确性，按照最佳提取条件组合进行平行试验，结果表明，该工艺下提取液的抗氧化能力即Trolox浓度为62 870μmol/L，与理论值（63 081μmol/L）接近，故响应条件具有较高的可靠性和重复性。

图4 时间和料液比对Trolox浓度的响应曲面及等高线图Figure 4 Trolox concentration response surface on time and solid to liquid ratio

2.3 提取物抗氧化活性的测定

2.3.1 提取物对DPPH自由基清除率的测定 根据微波提取法的最佳提取工艺制备诃子的提取物，称取提取物的干燥粉末适量，用水配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL溶液，根据1.2.3方法测定DPPH自由基清除率，结果见图5。

图5 DPPH自由基清除率的测定Figure 5 DPPH radicals clearance

由图5可知，随着诃子提取物浓度的增大，DPPH自由基清除率逐渐增大，当诃子提取物的浓度为1.0mg/mL时，DPPH自由基清除率达到90%以上，其IC50值为0.44mg/mL。

2.3.2 提取物对羟自由基清除率的测定 根据微波提取法的最佳提取工艺制备诃子的提取物，称取提取物的干燥粉末适量，用水配制成1.0，1.2，1.4，1.6，1.8mg/mL溶液，根据1.2.4方法测定羟自由基清除率，结果见图6。

图6 羟自由基清除率的测定Figure 6 Hydroxyl radicals clearance

由图6可知，随着诃子提取物浓度的增大，羟自由基清除率逐渐增大，当诃子提取物的浓度为1.8mg/mL时，羟自由基清除率达到80%以上，其IC50值为1.01mg/mL。

2.3.3 提取物对超氧阴离子清除率的测定 根据微波提取法的最佳提取工艺制备诃子的提取物，称取提取物的干燥粉末适量，用水配制成0.2，0.4，0.6，0.8，1.0mg/mL溶液，根据1.2.5方法测定超氧阴离子清除率，结果见图7。

由图7可知，随着诃子提取物浓度的增大，超氧阴离子清除率逐渐增大，当诃子提取物的浓度为1.0mg/mL时，超氧阴离子清除率达到80%以上，其IC50值为0.64mg/mL。

图7 超氧阴离子清除率的测定Figure 7 Super oxide anion clearance

2.4 提取物抑菌作用的测定

根据微波提取法的最佳提取工艺制备诃子的提取物，称取提取物的干燥粉末适量，用水配制成0.5，0.05，0.005g/mL溶液，进行抑菌试验，根据1.2.6方法测量抑菌圈直径大小，结果见表6。

由表6可知，当诃子提取物的浓度为0.5g/mL时，对金黄色葡萄球菌、白色念珠菌、大肠杆菌均具有较好的抑制作用，而对黑曲霉无抑制作用；当诃子提取物的浓度为0.05g/mL时，对金黄色葡萄球菌和白色念珠菌有抑制作用，而对大肠杆菌和黑曲霉无抑制作用；当诃子提取物的浓度为0.005g/mL时，对4种菌均无抑菌作用。诃子提取物对这4种菌的抑制作用大小顺序为：金黄色葡萄球菌、白色念珠菌＞大肠杆菌＞黑曲霉，其中金黄色葡萄球菌和白色念珠菌的最小抑菌浓度为0.005g/mL，大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.05g/mL。

表6 不同浓度提取液的抑菌作用测定Table 6 Different concentrations extract bacteriostatic action

3 讨论

（1）微波法提取诃子中抗氧化活性物质的最佳提取工艺为：温度为53.6℃，时间为3min，料液比为1∶19（m∶V），通过研究诃子的微波提取物对DPPH自由基、羟自由基和超氧阴离子的清除作用，可知诃子的微波提取物具有较好的抗氧化活性，对自由基的清除作用大小依次为清除DPPH自由基作用＞清除超氧阴离子作用＞清除羟自由基作用。

（2）诃子的微波提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌均有抑制作用，而对黑曲霉无抑制作用，抑制作用大小依次为抑制金黄色葡萄球菌、白色念珠菌＞抑制大肠杆菌＞抑制黑曲霉。

（3）自由基是机体氧化反应中产生的有害物质，能够损害机体的细胞和组织，甚至引起衰老效应或者慢性疾病，本试验对诃子的抗氧化活性进行了初步研究，为其在医药和保健等方面的深入研究和应用提供参考和依据，而对于诃子抗氧化活性成分的分离纯化方面还有待于进一步深入的研究。

1 国家药典委员会.ISBN 7－5025－6525－6/R·262中华人民共和国药典［S］.北京：化学工业出版社，2005.

2 杨怀霞，马庆一，杨林莎.茶叶及诃子等植物提取物的抗氧化作用［J］.郑州大学学报（医学版），2003，38（3）：413～415.

3 罗霄山，陈玉兴，张诚光.诃子不同炮制品抗氧化作用的试验研究［J］.中药材，2008，31（7）：966～967.

4 贝玉祥，郭英，何超，等.诃子多酚的提取分离、结构鉴定及抗氧化活性的研究［J］.食品研究与开发，2009，30（11）：6～9.

5 汪咏梅，陈笳鸿，吴冬梅，等.余甘子树皮提取物抗氧化及清除自由基活性初步研究［J］.林产化学与工业，2008，28（1）：11～15.

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13 刘明霞.化香树果序中多酚提取纯化工艺及体外抑菌活性研究［D］.陕西：西北大学，2009.

Research of antioxidant activity in fructus chebulae

WANG Shuang1WANG Chang－tao2DU Xiao－wei1

（1.Heilongjiang University of Chinese Medicine，Harbin，Heilongjiang150040，China；2.Beijing Technology and Business University，Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development，Beijing100048，China）

This experiment extracted antioxidant substances from Terminalia Chebulae Retz in Microwave method.Regard the antioxidant activity as an index，the effect of temperature，time，and the liquid ratio on the antioxidant activity was studied by the response surface analysis.Under the conditions of 53.6 ℃ extracting temperature，3 min extracting time，and liquid ratio 1∶19（m∶V），the concentration of Trolox is 63 081μmol/L.Products has scavenging action to DPPH radical，hydroxyl radical，superoxide anion，IC50were 0.44，1.01，0.64mg/mL respectively.And Staphylococcus aureus，Candida albicans，E.coliwere inhibited，while no inhibitory effect on Aspergillus Niger.

microwave；fructus chebulae；antioxidant activity；effect

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

北京市科技新星项目（编号：2008B08）

王双（1985－），女，黑龙江中医药大学在读硕士研究生。E－mail：wangs1985＠126.com

都晓伟

2010－07－12