绿豆多肽的制备工艺及抗氧化作用

傅 亮何 倩陈 勇孙颖莺

（1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.佛山市广粮饮料食品有限公司，广东 佛山 528137）

绿豆多肽的制备工艺及抗氧化作用

傅 亮1何 倩1陈 勇2孙颖莺2

（1.暨南大学食品科学与工程系，广东 广州 510632；2.佛山市广粮饮料食品有限公司，广东 佛山 528137）

以绿豆蛋白为原料，研究碱性蛋白酶酶解制备绿豆多肽的工艺，以水解度（DH%）为指标，得到酶解最佳条件为：酶与底物比（［E］/［S］）3.5%，温度55℃，pH 值9.0，底物浓度为2%，酶解时间为120min。抗氧化试验结果表明：绿豆多肽有良好的还原能力，其对羟自由基和超氧阴离子的清除作用的IC50分别是13.96，12.67mg/mL，抗脂质过氧化能力的IC50为15.77mg/mL。绿豆多肽在4种抗氧化体系中均表现出较强的抗氧化性。

绿豆；多肽；抗氧化

绿豆是一种豆科、蝶形花亚科豇豆属植物，富含蛋白质、糖类、多种微量元素和人体必需维生素，其中蛋白质含量高达19.5%～33.1%，是蛋白质的良好来源之一［1］。而且绿豆蛋白具有良好的起泡性和泡沫稳定性，以及乳化性等功能特性［2～3］。中国绿豆资源十分丰富。但大多数生产厂家都侧重于绿豆淀粉的加工生产，而忽略绿豆蛋白的开发［4］。

天然抗氧化肽由于具有很高的安全性和强抗氧化性，在医药、食品等行业的应用中已显示出它的优势，已经成为国内外的研究热点。目前已通过酶解大豆蛋白、大米蛋白、罗非鱼皮胶原蛋白等各种不同来源的蛋白质得到抗氧化肽［5～8］，但利用绿豆蛋白制备抗氧化肽的研究未见报道。本试验研究碱性蛋白酶酶解制备绿豆多肽的工艺，通过考察绿豆多肽的体外抗氧化性，为制备绿豆抗氧化肽提供理论和试验基础，同时为开发绿豆蛋白开拓新思路，深化绿豆的综合利用。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

绿豆蛋白：绿豆蛋白含量为77.85%，本实验室自制；

Alcalase碱性蛋白酶（粉末状）：酶活力为2×105U/g，广州齐云生物科技有限公司；

氢氧化钠、盐酸、三氯化铁、抗坏血酸、过氧化氢、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、铁氰化钾、水杨酸、三氯乙酸、硫酸亚铁、硫代巴比妥酸（TBA）：国产分析纯。

1.2 仪器

冷冻干燥机：FD－1型，北京博医康试验仪器有限公司；

胶体磨：DJM50L，上海东华高压均质机厂；

pH计：PHS－3C型，上海精密科学仪器有限公司；

低速离心机：KDC－12型，科大创新股份有限公司；

紫外可见光分光光度计：UV－9600型，北京瑞利分析仪器有限公司；

高速乳化搅拌机：JRJ－300－1型，上海标本模型厂；

集热式磁力加热搅拌器：DF－Ⅱ型，江苏省金坛市医疗仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 绿豆蛋白的制备 绿豆种子洗净去杂，加水浸泡12h，去皮后匀浆，调pH至9，搅拌20min后以3 000r/min离心20min，取上清液调pH至4，再次离心后取沉淀冷冻干燥，即得绿豆分离蛋白［9］。

1.3.2 粗蛋白质含量的测定 凯氏定氮法（GB/T 5009.5——2003）。

1.3.3 蛋白水解度的测定方法 pH－stat法［10］。按式（1）计算水解度：

式中：

B—— 消耗碱量，mL；

Nb——NaOH摩尔浓度，mol/L；

Mp—— 底物中蛋白质质量，g；

htot——每克蛋白质底物具有的肽键毫摩尔数，绿豆的htot为7.9meq/g；

α——α－的平均解离度。

1.3.4 绿豆多肽制备工艺优化的试验设计 称取适量绿豆蛋白溶于去离子水中，混匀。将溶液放置入酶解反应器中，将混合液调节到反应的温度和pH范围内，缓慢搅拌的同时加入适量Alcalase碱性蛋白酶，分别改变底物浓度1%～6%（pH为9.0，［E］/［S］为3.0%，温度为50℃，时间为60min）、pH值7.5～10.0（底物浓度为2.0%，［E］/［S］为3.0%，温度为50℃，时间为60min）、［E］/［S］为1.5%～4.0%（底物浓度为2.0%，pH为9.0，温度为50℃，时间为60min）、温度40～65℃ （底物浓度为2.0%，pH 为9.0，［E］/［S］为3.0%，时间为60min）、时间30～360min（底物浓度为2.0%，［E］/［S］为3.0%，pH为9.0，温度为50℃），考察对水解度的影响。在单因素试验的基础上利用4因素3水平L9（34）正交分析方法设计试验，得出最优工艺条件。

1.3.5 绿豆多肽抗氧化性的测定

（1）绿豆多肽还原力的测定：在25mL比色管中先加入1mL不同浓度的样品，再加2.5mL，1%的 K3Fe（CN）6溶液及2.5mL，pH 6.6的0.2mol/L磷酸盐缓冲液，混匀，50℃下保温20min，之后加入2.5mL，10%的 TCA，再次混匀后3 000r/min离心10min，取2.5mL上清液，然后加入2.5mL去离子水及0.5mL，0.1%的FeCl3溶液，混匀后在700nm测A值［11］。

（2）绿豆多肽对羟基自由基的清除作用：利用Fenton反应产生羟基自由基（·OH），水杨酸能够有效捕捉·OH，生成有色物质2，3－二羟基苯甲酸，其在510nm处有强吸收。

在25mL的比色管中依次移取5mL，2mmol/L硫酸亚铁溶液和5mL，6mmol/L双氧水溶液，混合均匀后用6mmol/L水杨酸溶液定容至刻度，摇匀后立即测Ao值。在Ao值测定体系中，加入1mL不同浓度样品溶液，摇匀后立即在510nm测A1值［12］。绿豆多肽浓度设计：0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00mg/mL。清除率按式（2）进行计算：

（3）绿豆多肽对超氧阴离子的清除作用：邻苯三酚在弱碱条件下发生自氧化反应产生O2－·，O2－·能加速邻苯三酚自氧化速率，O2－·抑制剂减缓其氧化速率，从而使氧化产物在325nm下的吸收峰减小。

依次取2.25mL，pH 8.34的50mmol/L磷酸盐缓冲液，去离子水2mL，0.25mL，10mmol/L的邻苯三酚在25mL比色管中，混匀后25℃下保温，准确计时3min后，立即加入1滴10mol/L盐酸使反应中止。在325nm测得A0值。在A0的测定体系中，加入2mL样液代替去离子水，即可测得绿豆多肽浓度设计：0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00mg/mL。清除率按式（3）进行计算：

（4）绿豆多肽抗脂质氧化作用：脂质体的制备参考文献［14］的方法并进行改良：新鲜卵黄加入 pH 7.4的 PBS（0.1mol/L）配成10% （V/V）悬浮液，在冰浴下高速乳化剪切10min，4℃超声波处理20min，4℃密封保存。使用前，磁力搅拌5min。

在25mL比色管中依次加入0.5mL脂质体，0.1mL一定浓度的样品，加去离子水至1mL，再加入0.05mL FeSO4（70mmol/L）后37℃恒温水浴0.5h。然后加入0.5mL TCA（10%）与1mL硫代巴比妥酸（1%），沸水中水浴10min后4 000r/min离心15min，上清液532nm处测定吸光度A1。对照管用去离子水代替样品测定吸光度A0［15］。绿豆多肽浓度设计：0.10，0.50，1.00，5.00，10.00，15.00，20.00，25.00mg/mL。抑制率按式（4）进行计算：

1.3.6 统计分析 所有数据用EXCEL软件分析处理，用平均数±标准差来表示，并采用二阶多项式进行拟合，但只适用于已知数据范围内的计算，不能外推。

2 结果与分析

2.1 正交试验设计优化碱性蛋白酶酶解条件

根据前期单因素结果，选择温度为50～60℃、pH为8～9、底物浓度为2%～4%，［E］/［S］为2.5%～3.5%进行4因素3水平（L9（34））的正交试验。水解时间为120min。因素和水平的取值及结果分析见表1～2。

表1 Alcalase碱性蛋白酶正交试验的因素水平设计Table 1 Design of factors and levels of orthogonal experiment for Alcalase protease

表2 Alcalase碱性蛋白酶正交试验结果Table 2 Results of the orthogonal experiment of Alcalase protease

由表2可知，影响水解反应的主次关系为C＞B＞A＞D，即［E］/［S］＞温度＞pH＞底物浓度；最优组合为C3B2A3D1。碱性蛋白酶水解绿豆蛋白的最佳条件为［E］/［S］3.5%，温度55℃，pH值9.0，底物浓度为2%，酶解时间为120min。照此条件进行验证实验，水解度达到23.90%。优于正交试验的9组试验结果。

2.2 绿豆多肽的抗氧化作用

2.2.1 绿豆多肽的还原能力 由图1可见，绿豆多肽样品随着浓度的增加，A700值增大，表明还原能力随之增大，还原力与其浓度成量效关系。在试验剂量范围内绿豆多肽还原能力比VC低。25.00mg/mL浓 度 的 绿 豆 多 肽A700值 为0.413±0.011，还原能力相当于0.38mg/mL浓度的VC。

图1 绿豆多肽和VC的还原力Figure 1 The reductive activity of mung bean polypeptide and VC

2.2.2 绿豆多肽对羟自由基的清除作用 由图2可知，绿豆多肽对羟自由基的清除能力随着浓度增加而增大，在25.00mg/mL时清除率达到57.33%±1.25%。其回归方程为y＝ －0.112 9x2＋4.847 9x＋4.329 2，R2＝0.983 9，求得绿豆多肽的IC50是13.96mg/mL，表现出对羟自由基良好的清除效果。

图2 绿豆多肽对·OH的清除效果Figure 2 The·OH scavenging effects of mung bean polypeptide

2.2.3 绿豆多肽对超氧阴离子的清除作用 由图3可知，在0.10～25.00mg/mL的浓度范围内，绿豆多肽对超氧阴离子表现出良好的清除效果，并随浓度的增加，清除率增大。在25.00mg/mL时达到65.79%±2.34%。其回归方程为y＝ －0.104 2x2＋5.137 4x＋1.636 3，R2＝0.994 4，求得IC50是13.96mg/mL，表明绿豆多肽对超氧阴离子有较强的清除作用。

2.2.4 绿豆多肽的抗脂质氧化能力 由图4可知，绿豆多肽对脂质过氧化的抑制率都随浓度的增加不断变大，且抑制率与浓度呈明显的量效关系。在25.00mg/mL时达到53.16%±2.5%，其回归方程为y＝ －0.107 3x2＋4.515 2x＋5.480 2，R2＝0.989 1，得IC50为15.77mg/mL，表明绿豆多肽对脂质氧化有较强的抑制作用。

3 结论

通过正交试验设计优化Alcalase碱性蛋白酶酶解绿豆蛋白工艺，得到制备绿豆多肽的最佳工艺为［E］/［S］3.5%，温度55℃，pH 值9.0，底物浓度为2%，酶解时间为120min。在此条件下试验，水解度达到23.90%。

图4 绿豆多肽的抗脂质氧化能力Figure 4 The antioxidant effects on lipids of mung bean polypeptide

本试验考察了绿豆多肽在4种化学体系中的体外抗氧化作用，25.00mg/mL浓度的绿豆多肽还原能力相当于0.38mg/mL浓度的VC，绿豆多肽对羟自由基和超氧阴离子的清除作用的IC50分别为13.96，12.67mg/mL，对脂质过氧化抑制作用的IC50为15.77mg/mL。在此4种体系中，绿豆多肽均证明了其良好的抗氧化能力。将试验制备的绿豆多肽与其他蛋白来源制备的抗氧化肽对比，其还原能力要高于大豆肽［3］，但低于罗非鱼皮胶原肽［6］；对·OH 的清除率却高于罗非鱼皮胶原肽以及大米蛋白肽［5］，但低于大豆肽［3］；对 O2－·的清除率高于大豆肽［4］，低于大米蛋白肽［5］；对脂质过氧化的抑制率高于罗非鱼皮胶原肽［6］。绿豆多肽在这4种体系中表现出不同的抗氧化能力，其具体原因仍有待研究。

1 徐娟，袁艳娟，屠春燕.胃蛋白酶水解绿豆分离蛋白的工艺［J］.生物加工过程，2008，6（4）：31～35.

2 刘冬儿，吕天喜.绿豆分离蛋白的制备及其功能特性的研究［J］.食品科技，2007，14（2）：27～30.

3 梁丽琴，袁道强.绿豆分离蛋白功能特性研究［J］.郑州轻工业学院学报（自然科学版），2005，20（1）：50～55.

4 刘咏，杨柳.绿豆蛋白质提取工艺的优化［J］.食品科学，2008，29（8）：272～274.

5 荣建华，李小定，谢笔钧.大豆肤体外抗氧化效果的研究［J］.食品科学，2002，23（11）：118～120.

6 王莉娟，陶文沂.大豆肽体外抗氧化活性研究［J］.生物加工过程，2008，6（4）：69～73。

7 陈升军，熊华，周侃，等.米蛋白短肽抗氧化活性研究［J］.食品科技，2008，33（12）：177～180.

8 刘小玲，林莹，尹秀华，等.罗非鱼皮胶原肽的制备及抗氧化活性研究［J］.食品与机械，2007，23（3）：92～95.

9 张恒，佘纲哲.绿豆分离蛋白的提取和应用［J］.中国粮油学报，1990，5（3）：2～5.

10 李积华，郑为完，张斌，等.绿豆蛋白的酶法水解－工艺研究［J］.食品研究与开发，2007，28（3）：69～73.

11 Yen－hun He，Fereidoon Shahidi.Antioxidant activity of green tea and its catechins in a fish meat model system［J］.Journal of Agric ulture Food Chemistry，1997（45）：4 262～4 265.

12 尹艳，高文宏，于淑娟，等.水溶性大豆多糖对羟基自由基抑制作用的研究［J］.食品工业科技，2009，30（8）：83～87.

13 贾之慎，杨贤强.茶多酚（TP）清除活性氧自由基O2－·和·OH的分光光度法研究［J］.中国茶叶，1993，19（1）：25～27.

14 Kuppusamy U R，Indran M，Balraj B R S.Antioxidant effects of local fruits and vegetable extracts［J］.Journal of Tropical Medicinal Plants，2002，3（1）：47～53.

15 Maelinda Daker，Noorlidah Abdullah，S Vikineswary，et al.Antioxidant from maize and maize fermented by marasmiellus sp.as stabiliser of lipid－rich foods［J］.Food Chemistry，2008（107）：1 092～1 098.

Preparation and effects of antioxidant activity of mung bean polypeptides

FU Liang1HE Qian1CHEN Yong2SUN Ying－ying2

（1.Dept.of Food Science and Engineering，Jinan University，Guangzhou，Guangdong510632，China；2.Foshan Guangliang Drink and Food Inc.，Foshan，Guangdong528137，China）

Mung bean polypeptides were produced by Alcalase hydrolysis mung bean protein.The degree of hydrolysis（DH%）was used as the indicators to determine the optimum enzymolysis conditions.The results showed：enzyme to substrate ratio（［E］/［S］）is 3.5%，temperature is 55℃，pH value is 9.0，mung bean protein concentration is 2%and hydrolysis time is 120min.The antioxidant activity of mung bean polypeptides were as follows：mung bean polypeptides had good reductive activity，theIC50of hydroxyl radicals scavenging，hydrogen peroxide scavenging and liposome peroxide were 13.96mg/mL，12.67mg/mL and 15.77mg/mL respectively.Mung bean polypeptides showed strong antioxidant capacity in the four antioxidant experiments.

mung bean；polypeptide；antioxidant activity

10.3969 /j.issn.1003－5788.2010.06.001

傅亮（1968－），男，暨南大学副教授。E－mail：fuliang＠188.com

何倩

2010－05－30