何小丹 姜 丹 陈 琛 储艳秋 丁传凡,*
翁志洁2 李建其2,*
(1复旦大学化学系激光化学研究所,上海市分子催化和功能材料重点实验室,上海 200433; 2上海医药工业研究院,上海 200040)
抗抑郁化合物SIPI5358与环糊精形成的非共价复合物
何小丹1姜 丹1陈 琛1储艳秋1丁传凡1,*
翁志洁2李建其2,*
(1复旦大学化学系激光化学研究所,上海市分子催化和功能材料重点实验室,上海 200433;2上海医药工业研究院,上海 200040)
用电喷雾电离质谱(ESI-MS)和串级质谱(MS/MS),并结合紫外光谱、荧光光谱等方法,研究一种芳烷醇哌嗪类抗抑郁化合物SIPI5358与α-、β-、γ-环糊精(CD)制备得到的非共价复合物.质谱分析结果显示,SIPI5358分子可以和α-CD生成配合比为1∶1的非共价复合物,而与β-、γ-CD生成不同配合比的非共价复合物.串级质谱的结果进一步验证β-CD与SIPI5358非共价复合物的组成.用紫外光谱和荧光光谱实验对液相中非共价复合物的形成进行了辅助研究,结果均再次验证了非共价复合物的生成.荧光光谱实验测得SIPI5358与β-CD反应的生成常数Kf=3.45×103mol·L-1.
环糊精;抗抑郁;非共价复合物;紫外光谱;电喷雾电离质谱;荧光光谱
抑郁症是一种常见的精神科的疾病,易于复发,需连续长时间服药,目前已成为全球范围内精神科自杀率最高的疾病之一.普遍公认的治疗抑郁症药物包括单胺氧化酶抑制剂(MAOI)和三环类抗抑郁药(TCA)在内的第一代抗抑郁药,和以选择性五羟色胺(5-HT)再摄取抑制剂为主的第二类抗抑郁药[1-2].单胺氧化酶抑制剂类药物曾一度广为应用,不久因引起高血压等严重副作用而被淘汰;而第二类抑郁药物大多具有阻断多种递质受体的效果,可能扰乱多种神经传导.因此,高效、低毒、副作用少的新药成为了研究的焦点.SIPI5358是上海医药工业研究院的李建其课题组根据药物作用靶点,定向设计和合成的具有自主知识产权的新型抗抑郁活性化合物,属于芳烷醇哌嗪衍生物[3],是针对5-羟色胺(5-HT)、去甲肾上腺素(NE)及多巴胺(DA)再摄取过程定向设计合成的分子,已经在动物实验中达到了预期的三重选择性抑制作用,体现出显著的抗抑郁活性,其不良反应较常规抗抑郁药物少,起效更快,是一种很有开发前景的化合物.然而,由于SIPI5358水溶性较差,目前尚不能达到临床应用的要求,因此需要寻找新的方法来增加SIPI5358的溶解度.
环糊精(cyclodextrin,简称CD)[4]是由环糊精糖基转移酶作用于淀粉或直链环糊精而形成的一类环状低聚糖,它是一种水溶性、非还原性、不易被酸水解、无毒、可食用、具有多孔性的白色晶体.常见的环糊精有α-CD、β-CD以及γ-CD 3种,它们分别由6-8个葡萄糖单元以1,4-糖苷键结合而成的[5].由于连接葡萄糖单元的糖苷键不能自由旋转,环糊精分子不是直筒状的圆柱体结构,而是呈现两端直径不同的圆筒形结构,其中环糊精的伯羟基围成了圆筒形的小口,而其仲羟基围成了圆筒形的大口.具有这种特殊结构的环糊精分子外缘亲水而内腔疏水,可以作为主体分子(host)包络各种适当的客体分子(guest),如有机分子等,通过疏水作用、氢键和范德华力等与嵌入疏水孔洞的客体分子组合成单分子非共价复合物[6-8].前人已经成功地用环糊精和药物结合形成非共价复合物的方法包合了抗肿瘤和抗高血压等药物[9-10]来提高药效.因此,可以尝试采用制备环糊精和SIPI5358非共价复合物来提高其溶解度.
近年来,非共价复合物在医药上得到了广泛的应用,实验表明,一些小分子与生物大分子均能生成非共价复合物[11-13],许多分析技术包括紫外-可见分光光度法、荧光光谱、核磁共振光谱[14]等都被用于检测非共价复合物.质谱技术凭借其高灵敏度、高精度和高速度的优势[15-18],有效地推动了非共价复合物的研究[19-23].例如Terrier等[24]在对该复合物进行碰撞诱导解离(CID)时,发现非共价复合物的电荷态和多聚碱性氨基酸的性质不同会导致不同的解离途径.最近,Liu等[25]用电喷雾质谱研究了22个黄酮类化合物(其中9个黄酮苷元,13个黄酮糖苷)与DNA三链形成非共价复合物,结果显示苷元的羟基位置、多糖的数量和黄酮类苷元的骨架在与DNA三链结合中起至关重要的作用,而糖苷展示比其相应的苷元对DNA三链有更高的键合能力.
SIPI5358,SIPI5357[26]和SIPI5838[27]分子结构的特点是都具有哌嗪母体,两端分别为苯基和萘基的系列衍生物,它们都具有抗抑郁活性,其中SIPI5838已进入临床前研究阶段[1].本实验室已经采用电喷雾质谱结合紫外光谱成功地研究了SIPI5357[26]和SIPI5838[27]与α-、β-CD形成的非共价复合物,质谱测量结果表明,SIPI5357、SIPI5838分子均可以与环糊精分子生成配合比(1∶1)的非共价复合物.这些非共价复合物的形成可以显著地提高该抗抑郁化合物在水溶液中的溶解度.动物实验表明药物水溶解度的提高可以有效地减小该抗抑郁化合物在体内的沉积,使得它们具有临床使用的可能.另外,紫外分光光度法的辅助研究表明非共价复合物可以在液相中生成.溶解度实验计算了SIPI5357、SIPI5838和两种环糊精分子在液相中的生成常数,表明非共价复合物的稳定程度为β-CD-SIPI5838>α-CD-SIPI5838,β-CD-SIPI5357>α-CD-SIPI5357.
前人研究结果[28]显示当客体分子为块状或长链化合物时,可能会形成一分子CD与两分子客体或一分子客体与两分子CD相结合的复合物,例如双氯芬酸钠(diclofenac sodium,简称DS)和β-CD形成的复合物中,不仅含有配合比1∶1的β-CD-DS产物,还含有配合比1∶2或2∶1的β-CD-DS产物.SIPI5838分子的两端分别为苯基和萘基,与CD分子相比,具有长链化合物的特点,具有形成2∶1的β-CDSIPI5838复合物的潜在可能性.然而,哌嗪类SIPI系列抗抑郁化合物形成的复合物可能有哪几种配合比到目前为止还没有完全明白,这引起了我们的研究兴趣.此外,以前的工作主要是针对哌嗪类抗抑郁化合物和α-、β-CD非共价复合物的研究,但尚未涉及γ-CD的研究,而且抗抑郁化合物SIPI5358和β、γ-CD非共价复合物的稳定性尚不明确.
本文在前面工作[27]的基础上,将采用电喷雾质谱等技术研究SIPI5358和α-、β-、γ-CD之间的非共价相互作用,确定有几种不同配合比的复合物,用荧光和紫外光谱法证明药物和环糊精在液相中的反应,并用荧光光谱法测定β-CD和SIPI5358反应的生成常数.
1.1 化学试剂
实验中所用的α-CD(纯度98%),β-CD(纯度98%),γ-CD(纯度99%)购于Sigma化学试剂公司(St.Louis,MO,USA),分子量分别为∶α-CD,972.86; β-CD,1134.98;γ-CD,1297.15.甲醇(纯度99.5%).抗抑郁化合物SIPI5358由上海医药工业研究院提供(纯度99%),相对分子质量467.1(不包含2HCl· 2H2O),其结构式如图1所示.
1.2 非共价复合物的制备
将SIPI5358溶于甲醇中,配成1×10-3mol·L-1的溶液a,将α-、β-、γ-CD分别溶于去离子水中,配成1×10-3mol·L-1的溶液,依次为溶液b、c、d.取1 mL溶液a分别和不同体积的溶液b、c、d混合,均配成5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5摩尔比的混合溶液,所有混合样品用50%(体积比)的甲醇稀释至10 mL后摇匀,得到三套不同摩尔比的反应液,放入30℃的恒温箱内反应24 h.取上述SIPI5358分别与α-、β-、γ-CD混合的三种反应液(1∶5)各1 mL进行混合,并用50%(体积比)的甲醇稀释至10 mL可得到混合溶液A.分别取5 mL溶液b、c、d和3 mL溶液a进行混合,用50%(体积比)的甲醇稀释至30 mL即溶液B,将溶液B在30℃恒温箱内反应24 h,即可得到SIPI5358同时与α-、β-、γ-CD反应的混合溶液B.
溶液a、b、c、d均用50%(体积比)的甲醇稀释至1×10-4mol·L-1,作为参比液.所制备的溶液用于电喷雾电离质谱、串级质谱、紫外光谱、荧光光谱的测定.
1.3 电喷雾电离质谱的测定
质谱测定所用的仪器装置为电喷雾电离-三重四极杆质谱仪(API III Plus,PE-Sciex,加拿大,m/z 2400).质谱仪的质量标定选用聚丙二醇(PPG)标准样品.所用的助喷雾气和帘气均为高纯氮气(99.999%).以1.2 μL·min-1的进样速度进行电喷雾电离产生样品离子.
1.4 串级质谱分析
为了探讨SIPI5358溶液和环糊精所生成的非共价复合物结构,我们还对质谱测量中所得到的非共价复合物离子进行了串级质谱分析,测量了此非共价复合物离子的碰撞诱导解离产物,所用的碰撞气体为高纯氩气.碰撞能量数值由四级杆Q0和碰撞池Q2的电压差[n(R0-R2)]计算而得,其中n为母离子电荷数,R0和R2分别为离子导引四极杆Q0和碰撞池Q2上的直流电压.
1.5 紫外光谱的测定
紫外-可见分光光度计(Agilent8453,Agilent公司,美国).紫外光谱在室温下测得,样品的光谱扫描范围190-260 nm.
1.6 荧光光谱的测定
荧光分光光度计(Cary Eclipse,Varian公司,美国).荧光光谱波长范围∶激发态200-900 nm.将荧光分光光度计设置为激发光栅和发射光栅都是5 nm,电压600 V,激发波长为280 nm,扫描速率600 nm·min-1.然后各取1.5 mL溶液a和溶液c放入石英比色皿中,立即放入荧光光度计中从开始扫描荧光发射谱图.从300 nm扫到500 nm,起初每间隔1 min扫描一次,直到荧光强度变化不大时开始扩大间隔.
1.6.2 用荧光光度计测定SIPI5358与β-CD的生成常数
每次取1 mL溶液a,依次与1、2、3、4、5、6、7、8 mL溶液c分别混合,共8组溶液,用50%(体积比)的甲醇溶液稀释到10 mL,重复3次.将上述混合液在30℃恒温箱中放置24 h.荧光光度计扫描设定及扫描范围同上.
2.1 α-、β-、γ-CD和SIPI5358的质谱测量结果
α-、β-、γ-CD和SIPI5358在电喷雾电离质谱图中均以带一分子水的单电荷离子存在,即[α-CD+ H3O]+、[β-CD+H3O]+、[γ-CD+H3O]+和[SIPI5358+H]+.它们的质谱峰m/z分别出现在991.0、1153.1、1315.2和467.8处.
2.2 α-、β-、γ-CD和SIPI5358的非共价复合物
质谱测量结果
选取我院2016年6月~2018年6月收治的624例危重疾病患者,回顾分析其临床资料:①男377例,女247例;②年龄16~92岁,平均(59.25±12.34)岁。
α-CD与SIPI5358以5∶1混合反应后得到的质谱图如图2所示,m/z=1440.5所对应的分子离子为[α-CD+SIPI5358+H]+离子,它表明,α-CD与SIPI5358之间有新的复合物生成.前人[28]曾经报道环糊精分子是含有较多羟基的低聚糖化合物,故SIPI5358客体分子和环糊精主体分子之间的结合力主要可能为氢键和疏水力.
β-CD和SIPI5358以5∶1混合反应后得到的质谱图如图3所示,形成的非共价复合物以及两者的配合比均能够从ESI质谱图上得出.值得注意的是, β-CD与SIPI5358混合反应后得到的质谱图(图3a)中除了生成两者配合比为1∶1的复合物之外,还有配合比为1∶2、2∶1两种形式存在.图3a中的三个离子的放大图分别列于图3(b,c,d),其中m/z=1035.5所对应的质谱峰为[β-CD+2SIPI5358+2H]2+离子(见图3b),m/z=1377.8所对应的质谱峰为[2β-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+离子(见图3c),m/z=1602.6所对应的质谱峰为[β-CD+SIPI5358+H]+离子(见图3d).与文献[27]中结构类似的SIPI5838比较,可以发现SIPI5838也可以与两分子β-CD反应,并生成m/z= 1348.6的[2β-CD+SIPI5838+2H]离子,SIPI5358分子中哌嗪的邻位连的是丁基,而SIPI5838分子中哌嗪的邻位连的是甲基,烷基基团的空间位阻对哌嗪衍生物与β-CD的结合也许会产生一定的影响,对这个问题还需做更多的工作才能作明确的解释.
γ-CD与SIPI5358以5∶1混合反应后得到的质谱图如图4所示.图4a为γ-CD与SIPI5358按5∶1混合反应后得到的质谱图,图4a中的三个离子的放大图分别列于图4(b,c,d),其中图4a中m/z=1116.1所对应的质谱峰为[γ-CD-2SIPI5358+2H]2+离子(如图4b),m/z=1539.9所对应的质谱峰为[2γ-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+离子(如图4c),m/z=1764.2所对应的质谱峰为[γ-CD+SIPI5358+H]+离子(如图4d).上述结果表明,同β-CD与SIPI5358形成的非共价复合物的结果类似,γ-CD与SIPI5358之间形成的复合物也是以1∶2、1∶1、2∶1三种形式存在.
综合比较图2-4中相同摩尔比反应物得到的1∶1复合物的质谱峰强度,可以看出γ-CD与SIPI5358反应强于α-,β-CD和SIPI5358反应,即三种环糊精和药物结合的程度依次为γ-CD>β-CD>α-CD.这一结果可能与环糊精的分子的大小以及SIPI5358的结构有关.α-、β-、γ-CD的空腔容积分别为0.174、0.262和0.427 nm3,也就是说空腔内径 γ-CD>β-CD>α-CD.在CD包合物中,化合物被包在CD的空腔中,通常将CD称为主体,而把进入其空腔内的化合物称为客体.作为主体的CD与客体分子形式包合物的一个基本要求是尺寸的匹配,即对SIPI5358分子中的有机基团具有识别能力.一般而言,由于α-、β-、γ-CD的空腔尺寸依次增大,可以稳定包结不同大小的分子,如α-CD的空腔尺寸适合包结单环芳烃,β-CD空腔尺寸适合包结萘环,而γ-CD的空腔尺寸适合包结苾、蒽等.由于SIPI5358分子中的两端含有一个苯基和一个带有—OCH3和—Cl的萘基,因此β-、γ-CD容易与萘基结合,而α-CD容易与苯基结合,导致三种环糊精和SIPI5358结合后生成的1∶1复合物稳定程度依次为γ-CD>β-CD>α-CD,该结果也被溶解度实验所证实[29],在该文中根据Higuchi-Connors法测得的SIPI5358与γ-CD、β-CD或α-CD形成的复合物的结合常数分别为175.2、29.2、15.4 mol·L-1.
2.3 α-、β-、γ-CD和SIPI5358按各种比例混合后的质谱检测
为了确认SIPI5358与环糊精生成的为特异性结合的非共价复合物,而不是分子团簇离子,我们将α-、β-、γ-CD和SIPI5358按摩尔比为5∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶5的不同比例混合后进行质谱检测后发现,改变反应物的配比会影响质谱峰的相对强度,但不会改变质谱峰m/z的位置,可见反应物的初始反应比不影响最终产物的生成,只影响复合物的相对生成量.它说明了SIPI5358与环糊精生成的为特异性结合的非共价复合物,而不是非特异性结合的分子团簇离子,因为反应物的初始浓度比将会决定团簇离子的大小,从而改变质谱峰的位置.
2.4 混合液A和B质谱测量结果
为了比较α-、β-、γ-CD和药物SIPI5358同时反应时相互之间的竞争关系,我们配制两种不同的溶液.溶液A为3份SIPI5358先与α-、β-、γ-CD分别按摩尔比1∶5反应,然后再将反应液混合在一起的混合溶液;而溶液B为3份SIPI5358同时与α-、β-、 γ-CD反应的混合溶液B(摩尔比,nSIPI5358∶nCD=3∶5).溶液A和溶液B的质谱图分别如图5a和图5b所示.对比图5a和5b,发现两张图中出现了三种环糊精和药物按1∶1、1∶2、2∶1结合的主要产物.
图5 混合溶液A(a)和B(b)电喷雾电离质谱图Fig.5 ESI-MS of mixture solutions A(a)and B(b) solution A:the reactant mixture of excess SIPI5358 with equimolar α-CD,β-CD,γ-CD,respectively;solution B:an equimolar mixture of α-CD,β-CD,γ-CD with excess SIPI5358
令人感兴趣的是在α-CD、β-CD、γ-CD三种环糊精中任意两种不同CD均可以与一个SIPI5358分子相结合并生成相应的产物,它们分别为m/z=1297.0所对应的[α-CD+β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+分子离子、m/z=1377.8所对应的[α-CD+γ-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+分子离子、m/z=1459.0所对应的[γ-CD+ β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+分子离子.值得一提的是在图5中m/z=1539.9所对应的[2γ-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+分子离子峰却未观察到,其主要原因可能是因为当一分子γ-CD与SIPI5358结合之后,较大的空洞内径使得另一γ-CD分子与SIPI5358分子中的苯基的键合作用不如β-CD或α-CD的强.
图5a和5b中两两对应的质谱峰的相对强度发生了明显的变化.在图5b中,α-、β-CD和药物结合的一价离子峰增强,即m/z=1440.5所对应[α-CD+ SIPI5358+H]+离子、m/z=1602.6所对应的[β-CD+ SIPI5838+H]+离子信号增强;另外多种二价离子的信号也增强,m/z=1035.5所对应的[β-CD+2SIPI5358+ 2H]2+离子、m/z=1377.8所对应的[2β-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+离子以及m/z=1116.1所对应的[γ-CD+ 2SIPI5358+2H]2+离子和 m/z=1297.0所对应的[α-CD+β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+离子峰强度均增强,其余的峰强度无明显变化.说明α-、β-、γ-CD同时和SIPI5358反应,与三种环糊精分别和药物反应结果是不同的,表明环糊精之间存在明显的竞争关系.
2.5 串级质谱分析结果
为了进一步确认β-CD和SIPI5358之间非共价复合物分子的组成,我们选择了β-CD+SIPI5358混合溶液中的[2β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+和[β-CD-2SIPI5358+2H]2+产物离子进行了串级质谱分析,即选出m/z=1377.8对应的[2β-CD+SIPI5358+H2O+2H]2+和m/z=1035.5对应的[β-CD+2SIPI5358+2H]2+离子作为前驱体离子进行碰撞诱导解离(CID)过程和产物分析,结果如图6所示.
碰撞能量固定为70 eV(>70 eV,SIPI5358会解离),碰撞气体密度CGT=80×1013molecules·cm-2.如图6a所示,来自于前体离子[β-CD+2SIPI5358+2H]2+(m/z=1035.5)的断裂碎片离子m/z=1602.6和m/z= 467.8分别可以归属于为[β-CD+SIPI5358+H]+和 [SIPI5358+H]+.进一步增大碰撞气体CGT至100× 1013molecules·cm-2,前体离子[β-CD+2SIPI5358+2H]2+完全解离,m/z=1035.5的离子峰信号消失,由此可见, m/z=1035.5对应的前体离子是β-CD和SIPI5358按配合比1∶2结合的复合物.碰撞能量固定70 eV, CGT=80×1013molecules·cm-2时,[2β-CD+SIPI5358+ H2O+2H]2+的CID实验的质谱图见(图6b).图6b中可以发现源于m/z=1377.8对应的前体离子[2β-CD+ SIPI5358+H2O+2H]2+的断裂碎片离子m/z=467.8和m/z=1153.1,它们分别可以归属于[SIPI5358+H]+和[β-CD+H2O+H]+离子,没有出现β-CD和SIPI5358按配合比1∶1结合的[β-CD-SIPI5358+H2O+H]+离子.根据串级质谱图6可以推断β-CD和SIPI5358反应以后可以生成复合物,β-CD与SIPI5358在复合物中的配合比可以为1∶2或2∶1.
需要强调的是长期以来用电喷雾质谱在气相中测得的非共价复合物质谱信号能否直接代表溶液中的产物还存在一定的争议[30].在电喷雾过程中解离或生成分子团簇(cluster)离子可能会造成测得的结果与溶液中的实际情况产生差异,在特定条件下电喷雾过程中可能会发生非特异性结合[31].一些重要的情况列举如下:(1)某些非特异性结合的复合物离子比特异性结合的离子在动力学上要稳定;(2)某些复合物离子从溶液转移到气相的过程中会发生离子相互作用强化而疏水作用弱化;(3)在分析试剂浓度较高时,会发生质谱信号相互抑制作用.例如, Klassen等[32]经研究发现对一个给定浓度的糖和碳酸酐酶(carbonic anhydrase)而言,单糖、二糖以及亲水的糖容易在纳升喷雾过程中与碳酸酐酶形成非特异性结合.然而,非特异性结合对碳酸酐酶的结构以及复合物的电荷态均不敏感,而且结合的配体数也远大于复合物的电荷态.因此,下面结合传统的溶液分析技术如紫外光谱等确认非共价复合物的形成.
2.6 SIPI5358分别与α-,β-,γ-CD形成的复合物
的紫外光谱图
为了验证SIPI5358可以和α-,β-,γ-CD在溶液中形成非共价复合物,而不是在气相中形成的的分子团簇,我们还测定了由SIPI55358和α-,β-,或γ-CD制备而成的复合物溶液的紫外光谱.
图8 SIPI5358与β-CD混合物在不同反应时间的荧光光谱图Fig.8 Fluorescence spectra for the mixture of SIPI5358 and β-CD with different reaction time
在实验中我们选用190-260 nm区间对α-,β-, γ-CD和SIPI5358以及它们1∶1混合后经反应得到的混合物溶液进行紫外光谱的检测,结果见图7.
在图7A中,曲线a,b分别代表α-CD溶液和SIPI5358溶液所测得的紫外光谱,曲线d则为两者进行简单理论叠加后应该出现的光谱,曲线c为实际测得两者混合后的光谱图.从图中可以看到,如果药物SIPI5358和α-CD是简单叠加,则应该在192.0 nm处都会出现较强的吸收.而实际得到的混合物吸收峰则发生了一定的偏移,即在192.5 nm处出现较强吸收,除了峰位置发生偏移外,峰形也有变化,说明将SIPI5358和α-CD混合后,再进行紫外光谱的检测,得到的紫外光谱不是反应物简单的叠加,而是有新物质生成.类似地β-CD与SIPI5358反应在193.1 nm处出现较强吸收(图7B),γ-CD与SIPI5358反应在193.0 nm处出现较强吸收(图7C).γ-CD或β-CD与SIPI5358反应后混合物吸收峰相对于简单叠加的偏移均约为1.1 nm,大于α-CD与SIPI5358反应后混合物吸收峰的偏移(0.5 nm).紫外光谱的结果表明CD和SIPI5358在溶液中可以生成非共价复合物,而γ-CD或β-CD与SIPI5358的结合强度要略大于α-CD.
图9 药物SIPI5358和不同浓度β-CD混合物的荧光光谱图Fig.9 Fluorescence emission spectra of SIPI5358 and β-CD with different concentrationscSIPI5358=1×10-4mol·L-1;104cβ-CD/(mol·L-1)∶(a)0,(b)1.0,(c)2.0,(d)3.0, (e)4.0,(f)5.0,(g)6.0,(h)7.0,(i)8.0
表1 SIPI5358与β-CD结合的生成常数和拟合线性方程Table 1 Linear equations and Kfvalues of β-CD with SIPI5358
2.7 药物SIPI5358与β-CD混合后的荧光光谱测定结果
从质谱的结果来看,β-CD和药物SIPI5358的反应情况较好,于是用荧光光谱进一步验证β-CD和药物SIPI5358相互反应及测定反应的生成常数.
图8中,对应0 min的曲线是未加β-CD的空白药物溶液,浓度也是1×10-4mol·L-1.从图8可以看出,随着反应时间的增加,药物SIPI5358和β-CD混合以后,混合溶液的荧光强度会有所增加,说明在发射波长为366 nm时生成了一种荧光更强的物质,证明两者发生了反应,反应10 min以后荧光强度几乎无变化,因此推测这一系列反应都属于快反应.
2.8 用荧光光度计测定SIPI5358与β-CD复合物的生成常数
图9为SIPI5358在1×10-4mol·L-1的浓度下与不同浓度β-CD(反应的荧光谱图blank是未加环糊精的空白药物,浓度单位均为mol·L-1).通过下式计算出β-CD和SIPI5358反应的生成常数和拟合线性方程列于表1.
其中F0是空白溶液的荧光强度,F∞为所有SIPI5358完全反应时的溶液的荧光强度.生成常数的平均值为Kf=3.45×103mol·L-1.
应用电喷雾电离质谱(ESI-MS)、串级质谱(MS/ MS)并结合紫外光谱、荧光光谱技术,研究了新型抗抑郁化合物SIPI5358(客体分子)与α-,β-,γ-CD(主体分子)所形成的非共价相互作用.实验结果表明,在溶液中,SIPI5358与α-,β-,γ-CD可以生成较为稳定的非共价复合物.使用ESI-MS及MS/MS技术,能够确定三种环糊精与SIPI5358之间非共价复合物的生成,并且可以快速和准确地确定复合物中主客体分子之间的配合比.研究证实药物SIPI5358可以和α-CD生成1∶1结合的产物,与β-,γ-CD则可以分别生成配合比为1∶2、1∶1、2∶1的非共价复合物.将三种环糊精和药物一起反应时,可以看出三种环糊精和药物之间的反应存在明显的竞争关系.另外,紫外光谱和荧光光谱实验测得的结果和ESI-MS得到的结果较为吻合,均证明在溶液中有新的复合物生成.用荧光光谱测得的生成常数Kf为3.45×103mol·L-1.本文的实验结果为今后利用质谱等技术研究环糊精与其他药物分子的非共价复合物打下了基础,并为以后解决提高药物溶解度的问题提供了新的思路和理论依据.
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∶March 5,2010;Revised∶June 7,2010;Published on Web:July 13,2010.
Non-Covalent Complexes of the Antidepressant Compound SIPI5358 with Cyclodextrins
HE Xiao-Dan1JIANG Dan1CHEN Chen1CHU Yan-Qiu1DING Chuan-Fan1,*WENG Zhi-Jie2LI Jian-Qi2,*
(1Shanghai Key Laboratory of Molecular Catalysis and Innovative Materials,Institute of Laser Chemistry, Department of Chemistry,Fudan University,Shanghai200433,P.R.China;2Shanghai Institute of Pharmaceutical Industry,Shanghai 200040,P.R.China)
Non-covalent complexes of α-,β-,and γ-cyclodextrin(CD)with the antidepressant compound SIPI5358 were investigated by electrospray ionization mass spectrometry(ESI-MS),tandem mass spectrometry(MS/MS),UV spectroscopy,and fluorescence spectroscopy.The ESI-MS experimental results revealed that SIPI5358 reacted with the α-,β-,and γ-CD to form complexes with different coordination numbers.The tandem mass spectra further confirmed the formation of non-covalent complexes of SIPI5358 with β-CD.Binding of the complexes was also confirmed by UV as well as fluorescence spectra.The formation constant Kfwas determined by fluorescence spectroscopy to be 3.45×103mol·L-1for the complex of SIPI5358 and β-CD.
Cyclodextrin;Antidepressant;Non-covalent complex;UV spectroscopy; Electrospray ionization mass spectrometry;Fluorescence spectroscopy
O641;O645
*Corresponding authors.DING Chuan-Fan,Email:cfding@fudan.edu.cn;Tel:+86-21-65105204.LI Jian-Qi,Email:lijq@sipi.com.cn.
The project was supported by the National Natural Science Foundation of China(30772623)and National Project in Significant Creation of New Drugs During the Eleventh Five-Year Plan Period,China(2009ZX09103-047).
国家自然科学基金(30772623)及国家十一五项目重大新药创制(2009ZX09103-047)资助项目