不同剂量三氧化二砷单独及联合顺铂对人宫颈癌移植瘤的作用及机制

周曦　陈忠东

[摘要] 目的 探讨不同浓度的三氧化二砷（As2O3）与顺铂单独或合用对宫颈癌裸鼠移植瘤的疗效和毒副作用。 方法 取人宫颈癌细胞接种于裸鼠的皮下，建立裸鼠移植瘤模型，按照用药的不同分为观察组六组与对照组一组，对照组给予生理盐水用药；观察组六组分别给予三氧化二砷单独使用、顺铂单独使用及顺铂联合三氧化二砷使用；通过流式细胞仪检测细胞凋亡率、HE染色观察用药后的毒副作用。 结果 观察组各组的瘤质量及细胞的凋亡率显著优于对照组，结果具有统计学差异（P<0.05）。观察组各组药物治疗后出现一定程度上的白细胞降低，顺铂药物组出现骨髓抑制明显；其他血红蛋白、血小板值较对照组显著下降；用药后观察组裸鼠的血尿素氨水平、丙转氨酶值有所升高；顺铂药物组的肝肾损伤较为明显，与对照组相比数值显著升高。 结论 三氧化二砷联合顺铂治疗宫颈癌移植瘤，有效的促进了癌细胞的凋亡，增强了抑制癌细胞增殖的作用，促进了临床的治疗效果，临床效果显著，值得推广。

[关键词] 宫颈癌移植瘤；三氧化二砷；顺铂；裸鼠

[中图分类号] R737.3 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-44-04

[Abstract] Objective To study the effect and toxicity of different concentrations of arsenic trioxide （As2O3） and cisplatin used alone or in combination on cervical cancer in nude mice. Methods Human cervical cancer cells were inoculated subcutaneously in nude mice， nude mouse xenograft modelas were divided into six observation groups and one control group according to the different treatment ，the control group was given normal saline treatment.The observation group of six groups were treated with arsenic trioxide alone， cisplatin alone and combined use of two.To detect apoptosis by flow cytometry， and the toxic side effect was observed by HE staining. Results Tumor mass and apoptosis rate of cell in observation group were significantly better than the control group， P<0.05.After the treatment，observation group appeared to blood cell decrease ， and cisplatin group appeared bone marrow suppression significantly.Hemoglobin， platelet values significantly lower than control group.After treatment， the nude mice blood urea nitrogen level， alanine aminotransferase values increased.Liver and kidney injury in cisplatin group increased obviously than the control group. Conclusion Arsenic trioxide combined with cisplatin in the treatment of cervical cancer xenograft promote the apoptosis of cancer cells and the clinical therapeutic effect effectively， enhanced the inhibition of cancer cell proliferation， it is worthy of promotion with good clinical effect.

[Key words] Cervical cancer xenograft； Arsenic trioxide； Cisplatin； Nude mice

宫颈癌是临床妇科常见的恶性肿瘤，其发病率及死亡率居妇科恶性肿瘤之首。近些年来，该病的发病率有逐年增高的趋势。目前，临床的综合治疗主要以手术及化疗为主，但化疗的药物毒副作用大，尤其是肝肾功能损伤及骨髓抑制，且耐药性的问题也逐渐增加，影响了临床化疗的效果[1-3]。因此，

寻找最佳的低毒高效化疗药物或增加已有化疗药物的效果具有重要的临床意义。故本实验通过对建立的宫颈癌裸鼠移植瘤模型实施不同剂量的三氧化二砷单独及联合顺铂的治疗，观察药物对肿瘤的抑制作用及产生的不良反应，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 人宫颈癌细胞的培养 宫颈癌细胞采用含100μg/mL的青霉素，100μg/mL的链霉素，10%小牛血清的RPMI-1640培养基中，在37℃，5% CO2饱和度的培养箱下培养，每天换液一次，2～3d传代一次，取对数生长期细胞用于实验。

1.2.2 移植瘤的建立 取对数生长期的宫颈癌细胞1×107/mL，将细胞悬浮液0.2mL注射于裸鼠的背部皮下，接种10～14d后，皮下移植瘤可达75～100mm3。

1.2.3 分组 按照用药的不同分为观察组六组与对照组一组，观察组六组用药情况如下：观察组一组给予三氧化二砷0.8mg/kg治疗；观察组二组给予三氧化二砷2.4mg/kg治疗；观察组三组给予顺铂5mg/kg治疗；观察组四组给予顺铂10mg/kg治疗；观察组五组给予三氧化二砷（0.4mg/kg）联合顺铂（2.5mg/kg）治疗；观察组六组给予三氧化二砷（1.2mg/kg）联合顺铂（5mg/kg）治疗；几组分别按照预定的给药途径（腹腔注射），隔日给药1次，10次（20d）为一个治疗疗程。临床治疗APL的患者三氧华二砷的治疗量为每日10mg/kg，人体重按60mg计算，即0.17mg/kg，约为小鼠LD50的1/71。

1.3 观察指标

1.3.1 成瘤率测定 成瘤时间、成瘤率（接种后有瘤裸鼠数/接种裸鼠总数×100%）及移植瘤的体积增长速率、移植瘤组织切片光镜（必要时电镜）观察组织形态学改变。

1.3.2 治疗效果观察 用药时间每周用游标卡尺测量移植瘤长短径2次，按照标准的公式计算出移植瘤的体积大小：移植瘤体积（V）=长径（L）×短径（W）2×0.52，测量体重2次，绘制体重生长曲线和移植瘤的生长曲线情况。末次给药后24h，处理全部裸鼠，切除皮下移植瘤，称重计算瘤重抑制率（%）。瘤重抑制率（%）=（1-处理组平均瘤重/模型对照组平均瘤重）×100%。组织切片HE染色光镜下观察移植瘤形态学改变。

1.3.3 流式细胞术检测技术 观察经过处理因素处理后，移植瘤的细胞凋亡情况。

1.3.4 毒副作用的观察 （1）体重称量：体重减轻率=（1-处理组去瘤后平均体重/正常裸鼠对照组平均体重）×100%，体重减轻率<20%为可接受治疗，≥20%为毒性大，动物不能耐受。（2）血液生化学的检测：末次对裸鼠给药24h后处理裸鼠的前须眼球并予以摘除取血，计数红细胞，进行Hb的测定、计数白细胞，通过离心方式取血清，测定出血清的乳酸脱氢酶（LDH，可反映出心肌与组织的损伤），血清谷丙转氨酶（γ-GT，反映出肝功能的损伤）、血清肌酐值（Cr，反映出肾功能的损伤）。骨髓像的检测：必要时可断裸鼠的骨上端，抽吸其骨髓进行涂片观察。各组取裸鼠三只其的心，肝，脾，肺，肾，脑做HE染色，观察药物对裸鼠各大主要脏器及全身各个系统的毒副影响。

1.4 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件进行统计分析，采用x2或t检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 几组药物对宫颈癌抑瘤作用情况比较

观察组各组的瘤质量及细胞的凋亡率显著优于对照组，结果具有统计学差异（P<0.05）。见表1。

2.2 三氧化二砷联合顺铂对Hela细胞凋亡的影响

采用流式细胞术检测细胞的凋亡率，结果表明：As2O3可以使体外培养的Hela细胞发生凋亡，在DNA直方图上可见凋亡峰。

2.3 使用药物后的不良反应

2.3.1 药物对裸鼠血常规的影响 观察组各组药物治疗后出现一定程度上的白细胞降低，顺铂药物组出现骨髓抑制明显；其他血红蛋白、血小板值较对照组显著下降。

2.3.2 药物对裸鼠肝肾功能的影响 用药后观察组裸鼠的血尿素氨水平、丙转氨酶值有所升高；顺铂药物组的肝肾损伤较为明显，与对照组相比数值显著升高。

3 讨论

宫颈癌是妇产科最常见的恶性肿瘤之一，其发病的原因尚不明确，但该病的发病率、死亡率居妇科肿瘤之首，在性生活紊乱、多产、早育、早婚的妇女中具有较高的患病率，宫颈癌危害较大，可引起女性的不孕、影响生理生活、对妇女的子宫造成致命的损伤及还可导致患者身体多个部位的病变，严重的影响了妇女的健康与生活，甚至危及患者的生命[4-5]。目前，临床的综合治疗主要以手术及化疗为主，而宫颈癌的化疗尤其是近年来采取的动脉插管介入治疗的化疗方式在宫颈癌晚期、复发患者和局部巨大肿瘤的术前化疗起着重要的作用，但化疗的药物毒副作用大，尤其是肝肾功能损伤及骨髓抑制，且耐药性的问题也逐渐增加，影响了临床化疗的效果[6-8]。

本实验比较不同浓度的三氧化二砷（As2O3）与顺铂单独或合用对宫颈癌裸鼠移植瘤的疗效和毒副作用的观察，顺铂作为治疗宫颈癌比较有效的药物，其作用的机理主要是与DNA双链形成交叉连接，导致细胞G0/G1期的阻滞[9-10]。但它和大多数抗肿瘤药物一样缺少选择性抑制肿瘤的作用，在杀伤肿瘤细胞的同时伴有较大的毒性[11]。尤其是肝肾功能损伤及骨髓抑制。因此寻找新的对宫颈癌有效的毒性小的药物或者利用它们增加已有化疗药物的疗效就显得尤为重要[12]。而三氧化二砷是中药砒霜的有效成分，其治疗急性早幼粒白血病的疗效显著且得到临床的肯定，近年来也逐渐开始了对实体瘤的研究，该药物可以抑制细胞的分裂，属于长春碱类的一种抗肿瘤药物，其对肿瘤的治疗作用是直接的作用于裸鼠微管蛋白与微管的动态平衡，可抑制管蛋白的聚合，并崩解分裂期的微管，通过阻断G2/M期细胞的有丝分裂，导致进入间期或分裂期的细胞死亡。还可能与下调端粒酶活性有关、直接损伤DNA、抑制肿瘤血管形成有关[13]。有报道三氧化二砷与其他化疗药物交叉耐药少。对恶性肿瘤细胞有较高的选择性[14]。三氧化二砷联合顺铂应用于治疗中，对肿瘤的抑制率显著优于单药的使用，也大大降低了用药后的毒副作用。两种药物各有所长，互为补充，联合应用增加了对肿瘤细胞的杀伤作用，起到了很好的抗肿瘤的效果。

本次研究通过不同剂量的三氧化二砷单独及联合顺铂对人宫颈癌移植瘤的作用及机制，经研究结果显示：观察组各组的瘤质量及细胞的凋亡率显著优于对照组，结果具有统计学差异（P<0.05）。观察组各组药物治疗后出现一定程度上的白细胞降低，顺铂药物组出现骨髓抑制明显；其他血红蛋白、血小板值较对照组显著下降；用药后观察组裸鼠的血尿素氨水平、丙转氨酶值有所升高；顺铂药物组的肝肾损伤较为明显，与对照组相比数值显著升高。

综上所述，三氧化二砷联合顺铂治疗宫颈癌移植瘤，有效的促进了癌细胞的凋亡，增强了抑制癌细胞增殖的作用，减少了药疗后毒副作用的发生，防止或延缓了耐药性的产生，促进了临床的治疗效果，临床效果显著，值得推广。

[参考文献]

[1] 吴宜林，王可可.MG132联合顺铂对人宫颈癌Hela细胞裸鼠移植瘤的影响[J].现代医学，2012，40（2）：55-56.

[2] 马才媛，王朝霞，张甜甜，等.IL-24联合顺铂对宫颈癌移植瘤生长抑制及侵袭力的影响[J].中华临床医师杂志（电子版），2013，21（24）：26-27.

[3] 何信佳，赵园园，孙英朝，等.As2O3对人宫颈癌裸鼠皮下移植瘤的抗肿瘤作用[J].齐鲁医学杂志，2010，25（4）：186-187.

[4] 张春.三氧化二砷抑制宫颈癌生长的体内试验研究[J].中国现代医学杂志，2011，21（34）：56-57.

[5] 马鹏举，岳双柱，王志刚，等.三氧化二砷联合顺铂抑制C6胶质瘤细胞增殖的实验研究[J].中国医药生物技术，2014，21（3）：156-157.

[6] 黄德峰，赵治国，马军等.三氧化二砷诱导SGC7901细胞凋亡及对bcl-2、cyclin D1表达的影响[J].中国现代医生，2010，48（4）：32-34.

[7] 程虹，黄守国，陈瑾，等.As2O3对卵巢癌顺铂耐药细胞株裸鼠腹腔移植瘤作用及其机制的探讨[J].中华肿瘤 防治杂志，2010，17（11）：36-37.

[8] 张春.三氧化二砷联合维生素C对耐药性肺腺癌裸鼠移植瘤Caspase-3、Survivin活性的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（24）：85-86.

[9] 熊秋迎，郭菲，李勇，等.NF-KB及其调控的miRNA在宫颈癌移植瘤及癌旁组织中的活化和表达[J].基础医学与临床，2014，34（1）：46-47.

[10] 梁琨，陈智毅，谢明星.超声微泡靶向破坏转染shRNA沉默Survivin表达诱导裸鼠宫颈癌移植瘤凋亡的研究[J].中华超声影像学杂志，2010，19（11）：45-46.

[11] 史永华，林晨，拉莱·苏祖克.三氧化二砷对裸鼠宫颈癌移植瘤的作用及机制[J].肿瘤防治研究，2011，38（42）：86-87.

[12] 王海琳，马戎，叶云飞，等.AG490对人宫颈癌裸鼠移植瘤STAT3信号转导通路的影响[J].中国药理学通报，2011，27（9）：63-64.

[13] 蔡洪培，邓志华，李石，等.三氧化二砷对正常肝细胞及肝癌细胞的影响[J].中华消化杂志，2012，19（5）：16-17.

[14] 田忠富，张爱清，高洪泉.三氧化二砷与顺铂联合诱导人卵巢H08910细胞凋亡的初步研究[J].中国实用医药，2013，8（6）：256-257.

（收稿日期：2014-10-07）