芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏结构和功能的影响

郭兆安　孟凡辰　于春江

[摘要] 目的 观察芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病（DN）大鼠肾脏结构和功能的影响。 方法 48只清洁级雄性Wistar大鼠按体重随机抽取40只，采用切除右肾加腹腔注射链脲佐菌素（STZ）的方法制备DN模型，造模成功后按24hTP高低，两头随机抽取分为模型组、缬沙坦对照组、芪蛭降糖胶囊低剂量组、芪蛭降糖胶囊高剂量组。另取8只大鼠行右肾假切术，腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。成模2d起各组给予相应浓度和剂量的药物，给药12周时观察DN大鼠24h尿蛋白定量（24hUPQ）、α1微球蛋白（α1-MG）、β2-微球蛋白（β2-MG）和血糖（BS）、血清肌酐（Scr）、血清胱抑素-C（Cystatin-C）的变化；测定血浆血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）、内皮素-1（ET-1）、一氧化氮（NO）；留取标本后处死所有动物，肾组织行HE染色、PAS染色、免疫组化染色，光镜下观察肾组织病变，PAS染色计算肾小球硬化指数（GSI）、肾间质纤维化指数（IF），电镜观察肾小球毛细血管超微结构；免疫组化检测肾组织转化生长因子（TGF）-β1的表达。 结果 12周后，模型组大鼠24hUPQ、α1-MG、β2-MG较假手术组显著增多（P<0.01），3个治疗组DN大鼠的24hUPQ、α1-MG、β2-MG较模型组明显减少（P<0.01），2个中药治疗组较对照组也明显减少（P<0.05～0.01），且呈剂量依赖性；模型组大鼠BS、Scr、Cystatin-C亦较假手术组显著升高（P<0.01），2个中药治疗组较模型组也明显降低（P<0.05～0.01），对照组BS与模型组相比无明显变化（P>0.05）。3个治疗组血浆AngⅡ、ET-1较模型组显著降低、NO显著升高（P<0.05～0.01）。HE染色显示，2个中药治疗组大鼠肾组织病理损害明显减轻，PAS染色显示2个中药治疗组大鼠肾组织GSI、IF显著减轻（P<0.01）。电镜观察显示，2个中药治疗组DN大鼠肾小球基底膜增厚和系膜增生、足细胞足突融合减轻。免疫组化检查显示2个中药治疗组DN大鼠肾组织TGF-β1的表达显著下调（P<0.01）。 结论 芪蛭降糖胶囊通过抑制AngⅡ的分泌，减轻血管内皮损伤，下调TGF-β1在肾组织的表达，减轻肾小球硬化和肾间质纤维化，改善肾组织病理损害，从而对DN起到治疗作用。

[关键词] 糖尿病肾病；芪蛭降糖胶囊；转化生长因子-β1；血管内皮损伤

[中图分类号] R277.5 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2015）01-31-06

[Abstrac] Objective To study effect of Qizhi Jiangtang Capsule （QJC） on renal structure and function of kedney in DN rats. Methods 48 male Wistar rats were randomLy divided into 5 groups（n=8）： the sham operation group，the model group，Valsartan group （control group）， the low-dosage of QJC group （low dosage group） and high dosage of QJC group （high dosage group）. Except the rats in the sham operation group，the other rats were established DN animal model by removal of the right kidney with intraperitoneal injection of STZ.Medicine was given to each group according to the designed concentration and dosage from 2 days of the model established. 24hUPQ， α1-microglobulin（α1-MG），β2- microglobulin（β2-MG）and serum creatinine（Scr）， Cystatin-C of DN rats were observed at 12th week. AngⅡ、ET-1 and NO were detected ，too. The kidney tissues was stained respectively by HE，PAS and immunohistochemical.Histological change in the kidney tissues was observed by HE stain. GSI and IF were calculated by PAS stain.Glomerular capillary ultrastructure was observed by electron microscopy. The expression of TGF-β1 was detected by immunohistochemical. Results At 12th week ， compared with the sham group， 24hUPQ、α1-MG、β2-MG of model group were significantly raised（P<0.01）. These indicators of 3 treated groups rats were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the control group，the above contents of 2 groups of QJC were obviously decreased （P<0.05-0.01），and dose-dependent manner. BS、Scr、Cystatin-C of the model group were also significantly raised（P<0.01）at same time.To compared with the control group，these indicators of 2 groups of QJC were obviously decreased （P<0.05-0.01）， BS of the control group was shown no significant change（P>0.05）. To compared with the control group，AngⅡ、ET-1 of 3 treated groups rats were significantly reduced（P<0.01）， NO were significantly raised（P<0.01）. HE staining showed that renal pathological damage were lessened by QJC. PAS stain showed that GSI、IF were significantly lessened in 2 traditional Chinese medicine treatment groups（P<0.01）.Electron microscopy observations show that thickening of glomerular basement membrane and mesangium hyperplasia were reduced by QJC， podocyte foot process fusion reduced. Immunohistochemical tests show that the expression of renal tissueTGF-β1 were down-regulated by QJC（P<0.01）. Conclusion Through secretion of AngⅡ was suppressed， vascular endothelial damage reduced，the expression of TGF-β1 in the renal tissues were down-regulated， structure and function of kidney tissues improved， DN is treated by QJC.

[Key words] Diabetic nephropathies； Qizhi Jiangtang Capsule； Transforming growth factor -β1；Vascular lesions

糖尿病肾病（DN）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）的首位[1]及严重并发症之一，也是导致慢性肾功能衰竭（chronic renal failure，CRF）的常见病因。临床研究表明[2-3]，芪蛭降糖胶囊不仅能明显降低DNⅢ期患者的尿mALB及mALB/Ucr，也能降低Ⅳ期患者的大量蛋白尿，稳定肾功能。实验研究表明[4-6]，芪蛭降糖胶囊能够通过下调肾组织中单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）、MCP-1 mRNA的表达，降低大鼠肾实质小动脉内膜/中膜厚度比，还能够通过抑制DN大鼠肾组织中VEGF的过度合成和沉积、减轻ECM在肾组织中的积聚，从而减轻DN大鼠肾组织和血管结构病理损害；通过干预BMP-7/Smads/TGF-β1信号转导通路抑制了TGF-β1信号的细胞内转导，对DN大鼠肾间质纤维化起到治疗作用。其发病机制涉及遗传、糖代谢紊乱、炎症介质、细胞因子、血流动力学改变等多种因素环节。为进一步探讨芪蛭降糖胶囊治疗DN的的作用机理，本研究用右肾切除加腹腔注射链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）的方法制备大鼠DN模型，用芪蛭降糖胶囊治疗，以缬沙坦为对照，观察芪蛭降糖胶囊对DN大鼠肾脏结构和功能的影响，共观察12周。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂

清洁级雄性Wistar大鼠48只，6～7周龄，体重（180±20）g，购于山东中医药大学动物实验中心。STZ（美国Sigma）、TGF-β1兔抗大鼠一抗多克隆抗体，通用型免疫组化试剂盒二抗，武汉博士德公司生产。芪蛭降糖胶囊，主要成分黄芪、水蛭、地黄、黄精，（吉林一正药业集团有限公司，Z10950116）。缬沙坦胶囊（代文），（北京诺华制药有限公司，H20040217）。

1.2 DN模型建立与分组

适应性饲养1周后，将48只Wistar大鼠按体重随机取40只，采用右肾切除加腹腔注射STZ60mg/kg（STZ溶于10mmol/L柠檬酸缓冲液，pH4.5，按照6mL/kg注射）的方法建立DN模型。DN大鼠造模成功条件为：空腹血糖≥13.9mmol/L， 24h尿蛋白定量（24 huors urine protein quantitative，24hUPQ）≥30mg。按照24hUPQ高低排序，两头抽取随机分为模型组、缬沙坦组（简称对照组）、芪蛭降糖胶囊低剂量组（简称低剂量组）、芪蛭降糖胶囊高剂量组（简称高剂量组）。另取8只正常大鼠行右肾假切除术，腹腔注射等量柠檬酸缓冲液作为假手术组。假手术组除不切除右肾外，余步骤与模型组相同。

1.3 给药

成模2d后按《实验动物学》根据大鼠体表面积计算给药量。假手术组、模型组给予生理盐水3mL灌胃，对照组给予缬沙坦28.8mg/（kg·d）（相当于成人用量的4倍）灌胃，低剂量组给予芪蛭降糖胶囊1.35g/（kg·d）（相当于成人用量的2倍）灌胃、高剂量组给予芪蛭降糖胶囊4.05g/（kg·d）（相当于成人用量的6倍）灌胃。将药物分别去其外包装，用生理盐水3mL稀释，所有大鼠在实验期间均自由摄食饮水，不使用胰岛素和其他降糖药。

1.4 观察指标和标本的采集与制备

实验观察12周（即实验结束）时，将DN大鼠进行尿液检查、血液检查、肾组织的采集与病理观察。

1.4.1 尿液检测 将大鼠放入单只代谢笼，禁食，给予充足饮水，收集24h尿液，测定24UPQ，并检测尿α1-MG、β2-MG。

1.4.2 血液检测 腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，下腔静脉取血3mL，分离血清，由生化室测定BS、Scr、Cystatin-C，核医学科用放免法严格按照试剂盒说明书操作测定AngⅡ、ET-1、NO。

1.4.3 肾组织检查 麻醉取血后，快速切取左侧肾脏，剥离包膜，沿纵轴切开，一侧液氮冻存，用于免疫组化分析；另一侧以10%福尔马林固定24h后，用70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，每一组织蜡块连续4μm切片六张，HE染色行常规光学显微镜观察、拍照，PAS染色观察肾小球和小管间质病理变化，分别采用Caij等半定量方法评估肾小球硬化指数（GSI）和间质纤维化指数（IF），半定量分析评估肾小球和小管间质病理改变。另取部分皮质固定，Epon812包埋，切片沿轴双重染色后，透射电镜观察。

1.4.4 免疫组化染色 采用免疫组化法检测TGF-β1的表达。用Qwin550CW型图像信号采集与分析系统进行灰度值测量。高倍镜下（400倍）每张切片分别取2个视野，每个视野面积约为0.1mm2。测量时每个视野随机测量4个随机面积内阳性染色的灰度值。每个观察指标在同一样本中制作2张切片。免疫组化结果判断：出现黄褐色反应为阳性，相同部位不出现黄色反应为阴性。根据显色强度和阳性细胞数两项指标判断阳性等级。按显色强度分为：无色、黄色、浅黄色、黄褐色。观察各指标是否胞浆表达。

1.5 统计学方法

各组数据均采用SPSS13.0软件进行处理，以（）表示，组间比较采用方差齐性检验。

2 结果

2.1 各组大鼠一般情况

因麻醉过度，死亡1只大鼠，灌胃期间，模型组死亡1只，余大鼠均无死亡。实验期间模型组大鼠皮毛蓬松，暗淡无光，精神萎靡，活动迟缓，食量减少，体重减轻。其余3个治疗组大鼠皮毛、精神、活动及饮食均好于模型组，高剂量组大鼠各方面情况接近假手术组大鼠。

2.2 各组大鼠尿液24hUPQ、α1-MG和β2-MG的比较

实验12周时，模型组大鼠24hUPQ、α1-MG和β2-MG均较假手术组显著升高（P<0.01），对照组、低剂量组、高剂量组均低于模型组（P<0.01），而且三组依次降低，组间比较有统计学差异（P<0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠BS、Scr、Cystatin-C的比较

在实验12周末，模型组大鼠BS、Scr、Cystatin-C均较假手术组显著升高（P<0.01），对照组Scr较模型组显著降低（P<0.01），而BS、Scr、Cystatin-C较模型组降低不明显（P>0.05），低剂量组、高剂量组均显著低于模型组（P<0.01），高剂量组与低剂量组比较也有差异（P<0.05）。见表1。

2.4 各组大鼠血浆AngⅡ、ET-1、NO的比较

实验终止时，模型组AngⅡ、ET-1显著高于假手术组、NO显著低于假手术组（P<0.01）。3个治疗组和模型组相比，AngⅡ、ET-1显著降低，NO显著升高（P<0.01）。和对照组相比，低剂量组AngⅡ明显偏高（P<0.05），ET-1、NO无显著差异（P>0.05）；和低剂量组相比，高剂量组AngⅡ、ET-1明显降低（P<0.05）。见表2。

2.5 各组大鼠肾脏组织学改变

2.5.1 HE染色 假手术组肾组织结构正常，模型组大鼠与假手术组相比，肾小球肥大，部分肾小球萎缩，GBM弥漫增厚，毛细血管扩张，系膜基质增生明显，肾小管管腔扩张明显，上皮细胞排列紊乱，并有坏死脱落，球囊粘连现象较明显，纤维化程度高。对照组和低剂量组病变有所减轻，高剂量组肾小球肥大明显减轻，部分系膜基质增生、基底膜增厚，但程度明显减轻，部分肾小管扩张，肾小管修复现象明显。见图1。

2.5.2 PAS染色 模型组大鼠肾小球毛细血管腔狭

2.5.3 电镜 假手术组大鼠肾组织结构清晰，无明显病理改变。模型组GBM均质性增厚，外疏松层、致密层和内疏松层分层错杂，系膜基质增多明显，系膜细胞增生积聚处可见小结节团块状，内皮细胞之间窗孔间隙变大，内皮细胞增生显著，足细胞足突广泛融合，肾小囊可见玻璃滴状病变。对照组和低剂量组病变较模型组轻，高剂量组GBM略增厚，三层滤过膜分布清晰，系膜基质轻度增生，内皮细胞之间窗孔间隙未见明显扩大，足细胞足突融合不明显，肾小囊无玻璃滴状病变。见图3。

2.5.4 各组大鼠肾组织TGF-β1的表达 假手术组着色最浅，说明TGF-β1蛋白表达极少。DN模型组大鼠肾组织TGF-β1蛋白呈强阳性表达，表现为黄褐色颗粒状沉积，着色较深，较假手术组明显增强，两组间的灰度值具有显著性差异（P<0.01）。对照组、低剂量组、高剂量组大鼠肾组织的着色逐渐变浅，TGF-β1表达逐渐减弱，各治疗组与模型组间灰度值差异具有统计学意义（P<0.05），低剂量组与对照组间、高剂量组与低剂量组间灰度值有明显差异（P<0.05）。见图4、表2。

3 讨论

糖尿病发病机制中，AngⅡ可以通过血流动力学和非血流动力学产生双重作用[7]，经过多种途径诱导肾小球GBM中Ⅳ型胶原蛋白合成。动物试验已证实尿蛋白水平与肾脏进行性损伤的进展速度呈正相关，这种损伤表现为巨噬细胞浸润和细胞外基质的沉积，最终可导致肾小球的硬化[8]。AngⅡ还可通过非血流动力学效应直接介导肾脏细胞增生以及诱导细胞合成分泌TGF、肿瘤坏死因子、血小板源性生长因子、ET、白细胞介素[9]和血小板活化因子。这些细胞因子在DN中的作用涉及肾小球血流动力学改变、细胞外基质代谢、细胞增生和细胞肥大等。有研究[10]表明高糖诱导培养的内皮细胞Ang-Ⅱ表达上调，Ya-mamoto等[11]也发现2～3周的STZ糖尿病小鼠肾脏Ang-Ⅱ蛋白表达上调，这与我们的实验结果相一致，提示在糖尿病肾脏存在Ang-Ⅱ异常表达，AngⅡ导致TGF-β1表达明显增加，刺激氧自由基及细胞因子的释放，抑制细胞增殖，介导细胞凋亡[12]。TGF-β1直接和间接的上皮-间充质转分化（EMT）作用可使上皮细胞转化为成纤维细胞表型，从而具有了产生ECM的能力，参与了肾纤维化过程。通过干预DN状态下的TGF-β1升高，阻断其信号转导可抑制肾脏纤维化[13]。

血管内皮细胞功能损伤是DN发生发展的重要病理基础。血管内皮损伤表现为血管收缩与舒张功能失调。NO是内皮细胞释放的有效的血管扩张剂，在保持血管稳态上起关键作用。NO可以调节血管内皮细胞分泌合成ET的生理作用，ET除作用于血管平滑肌细胞膜上的ETA受体引起血管收缩外，同时还作用于血管内皮细胞上的ETB受体，刺激NOS增加NO的合成，从而负反馈地抑制ET收缩肾脏血管的作用。NO的释放减少或活性降低可能是血管功能障碍和动脉粥样硬化形成的原因之一[14]。ET-1是唯一被认为系内皮细胞基础分泌的内皮素，也是目前已知作用最强和持久的缩血管物质[15]。DN早期，ET-1表达下调参与了肾小球高滤过和高灌注的形成[16]。随着DN的进展，糖基化终末产物、TGF-β1等增加则促进了ET-1的增加，加速DN进展[17]。肾脏既是ET合成代谢的重要场所，又是其主要的靶器官，因此血浆ET水平可反映肾脏受损的严重程度。

芪蛭降糖胶囊具有益气养阴、活血通络的功效。中医对于消渴、水肿的研究也有着丰富的经验，然而有效的中成药在临床中很少被证实，DNⅢ期和Ⅳ期以气阴两虚、瘀血阻络为基本病机，而芪蛭降糖胶囊正是针对此病机而组方，黄芪补气健脾，利尿消肿，水蛭逐瘀消徵，黄精与黄芪配伍，加强黄芪补气养阴的作用，同时能补益肾精，生地黄既能清热养阴，又能生津止渴，标本同治。本研究用右肾切除加腹腔注射STZ的方法复制DN大鼠动物模型，芪蛭降糖胶囊治疗后，DN大鼠血浆AngⅡ分泌明显减少，ET-1、NO改善，肾组织TGF-β1表达显著下调，GSI、IF显著下降，肾功能稳定，尿24hUPQ、α1-MG和β2-MG排泄减少，表明芪蛭降糖胶囊通过抑制AngⅡ分泌、保护血管内皮细胞、下调肾脏组织TGF-β1表达，而起到治疗DN的作用。

[参考文献]

[1] 刘焱，王学美.400例2型糖尿病患者中医证型与糖尿病慢性并发症、生存质量及实验室指标的相关研究[J].中国中西医结合急救杂志，2010，17（2）：76-79.

[2] 郭兆安，于春江，李悦，等.芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾病Ⅲ期的临床研究[J].中国中西医结合急救杂志，2013，20（5）：5-9.

[3] 郭兆安，于春江，柳刚，等.芪蛭降糖胶囊治疗糖尿病肾脏疾病3b期大量蛋白尿的多中心、随机对照研究[J].中国中西医结合杂志，2014，34（9）：1047-1052.

[4] 李悦，于春江，郭兆安，等.芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾实质小动脉内膜/中膜厚度比与炎性因子的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2013，14（10）：858-863-942.

[5] 武帅，郭兆安，于春江，等.芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织BMP-7及TGF-β1/smads信号传导通路的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2014，15（4）：297-301.

[6] 孟凡辰，郭兆安，于春江，等.芪蛭降糖胶囊对糖尿病肾病大鼠肾组织血管内皮细胞生长因子及细胞外基质的影响[J].中国中西医结合肾病杂志，2014，15（8）：676-681.

[7] 秦会娟，温玉洁，刘陶文.血管紧张素转化酶抑制剂联合血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂应用于糖尿病肾病的研究进展[J].医学综述，2012，18（1）：124-126.

[8] 徐茜，汤正义，杨洋，等.局部肾素-血管紧张素-醛固酮系统与糖尿病肾病的治疗[J].世界临床药物，2008，29（11）：647-650.

[9] Luther JM，Gainer JV，Murphey LJ.AngiotensinⅡinduces inter-leukin-6 in humans through a mineralocorticoid receptor-dependent mechanism[J].Hypertension，2006，48（6）：1050-1057.

[10] Atchell SC，Mathieson PW.Angiopoietins：microvascular mod-ulators with potential roles in glomerular pathophysiology[J].J Nephrol，2003，16（2）：168-178.

[11] Yamamoto Y，Maeshima Y，Kitayama H，et al.Tumstatin pep-tide，an inhibitor of angiogenesis，prevents glomerular hypertro-phy in the early stage of diabetic nephropathy[J].Diabetes，2004，53（7）：1831-1840.

[12] Cao YP，Wang J，Li H，et al.Losartan provides protection on the kidney of diabetic rats by inhibition of endoplasmic reticulum-specific apoptosis pathway[J].Chin Pharmacol Bull，2010，26（ 8） ：1068 -1071.

[13] 许佳音，薛秉玮.血管紧张素转化酶抑制剂在糖尿病肾病中的作用机制[J].海峡药学，2012，24（2）：183-184.

[14] 刘斌，许惠琴，吴诚.生地-山茱萸对糖尿病大鼠血管的保护作用[J].中国老年学杂志，2012，32（13）：2750-2752.

[15] Sakurai K，Cominacini L，Garbin U，et al.Induction of Endothelin-1 Production in Endothelial Cells Via Co-Operative Action Between CD40 and Lectin- like Oxidized LDL Receptor（LOX-1）[J].J Cardiovasc Pharmacol，2004，44：S173-S180.

[16] Ding SS，Qiu C，Hess P，et al.Chronic endothelin receptor blockade prevents both early hyperfiltration and late overt diabetic nephropathy in the rat[J].J Cardiovasc Pharmacol，2003，42（1）：48-54.

[17] 柳飞，黄颂敏.肾小球内皮细胞损害与糖尿病肾[J].华西医学，2007，22（2）：446-446.

（收稿日期：2014-10-15）