枯草芽孢杆蔚BS-05产纤维素酶条件的研究

涂宗财,江国忠,刘益东,刘成梅,张秋婷

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

枯草芽孢杆蔚BS-05产纤维素酶条件的研究

涂宗财,江国忠,刘益东,刘成梅,张秋婷

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,江西南昌 330047)

以实验室筛选的枯草芽孢杆菌产纤维素酶菌株BS-05为出发菌株,对其产纤维素酶条件进行了研究。实验结果表明,菌株BS-05产纤维素酶的最佳条件是:以2%的CMC-Na为碳源,2%的蛋白胨和2%的酵母粉为氮源,产酶培养基初始 pH为7,装液量为 60mL/250mL,接种量 5%,在37℃,150r/min下培养48h。在此条件下,该菌株产酶能力最强,羧甲基纤维素酶活力CMCA达 195.46U/mL,滤纸酶活力 FPA达 174.52U/mL。

枯草芽孢杆菌,纤维素酶,产酶条件,优化

枯草芽孢杆菌 (B acillus subtilis)为革兰氏阳性细菌,嗜温、好氧,生理特征丰富多样,分布广泛,极易分离培养[1],可产生蛋白酶、α-淀粉酶、纤维素酶和木聚糖酶[2]等十多种酶,且发酵周期短,应用前景广阔。纤维素是自然界中存在最广泛的一类碳水化合物,也是地球上最丰富的再生资源,约占生物总量的50%。但由于组成结构的复杂性,其转化利用一直是个难题[3]。绝大多数纤维素未被利用,若将其转化为人类急需的能源、食物和化工原料,将对缓解人类社会环境污染、食物短缺和能源危机有重大意义[4],而利用微生物产纤维素酶的降解作用,是纤维素资源开发利用的有效途径之一。产纤维素酶的微生物广泛分布于真菌、细菌、放线菌等菌属中,目前的研究基本集中在真菌方面,主要有木霉属、曲霉属和青霉属等[5-7],但是都不同程度地存在着酶活力不高、生产周期过长等问题。因此,对繁殖快、周期短、产纤维素酶的细菌进行产酶研究,具有重要的现实意义和广阔的应用前景。本文即以一株实验室前期筛选的产纤维素酶的枯草芽孢杆菌 BS-05为出发菌株,研究其产酶的最佳条件,为该菌的进一步开发应用及纤维素的有效利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

所用菌种 实验室前期筛选到的一株产纤维素酶的枯草芽孢杆菌 BS-05;保藏培养基 牛肉膏0.5%,蛋白胨 1%,氯化钠 0.5%,琼脂 2%,蒸馏水, pH7.2～7.4;筛选培养基 CMC-Na 1%,蛋白胨 1%,酵母粉 1%,NaCl 0.5%,KH2PO40.02%,MgSO40.02%,琼脂 2%,蒸馏水,pH7.2～7.4;种子培养基保藏培养基不加琼脂;产酶培养基 碳源,氮源, NaCl 0.5%,K2HPO40.02%,MgSO40.02%,pH待定。

LDZX40B I高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂; T6新世纪紫外分光光度计 北京普析通用仪器有限公司;HH-4数显恒温水浴锅 国华电器有限公司; PYX-150H-B型恒温恒湿培养箱 广东韶关科力实验仪器有限公司;THZ-82(A)数显水浴恒温振荡器江苏金坛荣华仪器制造有限公司;T DL-5-A离心机 上海飞鸽系列离心机厂;其它常规玻璃仪器。

1.2 实验方法

1.2.1 产酶培养及粗酶液的制备 将菌株 BS-05从保藏斜面接种于筛选培养基平板,恒温培养箱中37℃活化 24h后,接种于装有 40mL种子培养基的250mL三角瓶中,水浴摇床中 37℃、150r/min培养12～24h,生成种子液。再按一定接种量将种子液接于产酶培养基中,并按一定条件培养产酶。培养液4800r/min离心 15min,取上清液,即为粗酶液。

1.2.2 纤维素酶活力的测定[8]参见文献[8]。

1.2.3 液体发酵产酶条件的研究 对影响菌株BS-05产纤维素酶的多个影响因素进行单因素实验,再正交优化,获得菌株产酶的最优条件。

2 结果与讨论

2.1 最佳碳源、氮源的选择与确定

以 2%的蛋白胨为氮源,再分别以 1%的CMC-Na、葡萄糖、蔗糖、淀粉、牛肉膏、豆渣、稻草杆屑、甘蔗渣和米糠为受试碳源,按 2%的接种量将液体种子接种于装有 40mL营养液的 250mL的三角瓶中,通气塞封口,摇床内 37℃、150r/min培养 36h,提取粗酶液并测定其羧甲基纤维素酶活力 CMCA及滤纸酶活力 FPA,实验结果如图 1。由图可知,以CMC-Na为碳源时,菌株 BS-05产纤维素酶活力CMCA与 FPA都取得最高值。

图 1 碳源的选择

以最佳碳源CMC-Na为碳源,质量浓度为 1%,再分别以 2%的蛋白胨、酵母粉、(NH4)2SO4、KNO3, NH4Cl,NH4NO3、尿素和豆渣为受试氮源,按碳源选择实验同样参数培养产酶,结果见图 2。

图 2 氮源的选择

由图 2可知,以蛋白胨与酵母粉为氮源时,菌株BS-05产纤维素酶活力最高,但 CMCA与 FPA分别在以蛋白胨和酵母粉为氮源时达最高值。为使所产纤维素酶系中组分均衡,选择蛋白胨与酵母粉的等量混合物为最佳氮源。值得注意的是,菌株 BS-05产纤维素酶的最佳碳源和最佳氮源与筛选获得该菌株所用的碳源和氮源相同,这可能是由于纤维素酶是诱导酶[9],而枯草芽孢杆菌产纤维素酶一定程度上可能也具有诱导性。

2.2 碳源与氮源比例的确定

确定最佳碳源与氮源后,改变二者在培养基中的比例,按碳源选择实验同样参数培养产酶,结果见图3。

图 3 碳源与氮源用量比的确定

结果表明,培养基中 C/N对菌株BS-05产纤维素酶有一定的影响。纤维素酶活力CMCA与 FPA均总体上随 C/N的减小而上升,达峰值后有所下降,并在C/N为2%/4%时,CMCA及总酶活力(CMCA与FPA之和)最大,因此,C/N应为 2%/4%。

2.3 接种量对菌株产酶的影响

其它条件相同,设定不同接种量,考察其对菌株BS-05产纤维素酶的影响,结果如图 4。

图 4 接种量对产酶的影响

由图 4可知,菌株 BS-05产纤维素酶活力CMCA与 FPA分别在接种量为 5%和 4%时最高,并分别在 3%～5%和 3%～4%间基本稳定。考虑总酶活力,接种量应为4%。

2.4 培养温度对菌株产酶的影响

其它条件相同,设定不同的培养温度,考察温度对菌株BS-05产纤维素酶的影响,结果如图 5所示。

图 5 培养温度对产酶的影响

由图可知,菌株 BS-05产纤维素酶受培养温度的影响较大。酶活力 CMCA与 FPA均在 37℃时最高,其它温度下,该菌株均不能正常代谢产酶,酶活力都较低。

2.5 培养时间对菌株产酶的影响

其它条件相同,设定不同的培养时间,考察其对菌株BS-05产纤维素酶的影响,结果如图 6所示。

图 6 培养时间对产酶的影响

由图可知,菌株 BS-05所产纤维素酶活力CMCA与 FPA均在 48h达最大值,之后随时间的延长略有降低。

2.6 初始 pH对菌株产酶的影响

其它条件相同,设定不同的培养基初始 pH,考察其对菌株BS-05产纤维素酶的影响,结果如图 7所示。

图 7 培养基初始pH对产酶的影响

结果显示,培养基初始pH对菌株BS-05产纤维素酶影响较大,酶活力 CMCA与 FPA分别在 pH7和pH6时获得最大值。而 pH7时 CMCA与总酶活力均较 pH6时高,因此,最适培养基初始 pH应为 7。

2.7 装液量对菌株产酶的影响

其它条件相同,设定不同的培养基装液量,考察其对枯草芽孢杆菌 BS-05产纤维素酶的影响,结果如图8。

图 8 装液量对产酶的影响

由图可知,装液量在一定范围内对该菌株产纤维素酶影响不大,但 CMCA与 FPA分别在装液量超过60mL与 70mL后逐渐降低。原因可能是装液量增多,单位体积培养液中的溶氧量随之下降,影响了菌株BS-05的好氧发酵和产酶,因此装液量以 60mL为宜。

2.8 产酶条件的正交优化

为研究枯草芽孢杆菌BS-05产纤维素酶的最佳培养条件,设计正交实验对各影响因素综合考察。由于培养温度与培养基初始 pH对菌株BS-05产纤维素酶影响较大,因此,优化实验在确定培养温度为37℃、培养基初始 pH为 7的前提下,针对接种量、培养时间和装液量进行。因素水平表见表 1,正交实验结果与分析见表 2～表 4。

表 1 正交实验因素水平表

表 2 正交实验结果

表 3 实验结果直观分析表

表 4 实验结果方差分析表

实验结果表明,菌株产酶活力 CMCA与 FPA的因素影响均为B>A>C,即培养时间影响最大,接着依次为接种量与装液量。不同的是,CMCA的优化条件为 A3B2C2,而 FPA为 A2B2C2,即接种量影响菌株BS-05产纤维素酶系的组分。分别按 4%与 5%的量接种培养,结果显示,接种量为 5%时,CMCA与 FPA分别为 195.46U/mL和 174.52U/mL,较接种量为 4%时的CMCA与总活力更高。因此,菌株BS-05产纤维素酶的最优培养条件为:培养温度 37℃、培养基初始 pH7、接种量 5%、培养时间 48h、装液量 60mL,在此条件下,枯草芽孢杆菌 BS-05产纤维素酶能力最强,酶活力最高,CMCA与 FPA分别达 195.46U/mL和174.52U/mL。

3 结论

通过对枯草芽孢杆菌BS-05产纤维素酶的营养条件与培养条件进行研究,结果表明,不同的碳源、氮源及 C/N比和温度、时间、接种量、装液量及培养基初始 pH等因素均对该菌株产纤维素有一定的影响。菌株BS-05产纤维素酶的最优条件为:以 2% CMC-Na为碳源,2%蛋白胨与 2%酵母粉为氮源,培养基初始 pH7,装液量 60mL/250mL,接种量 5%, 37℃,150r/min条件下培养 48h,该菌株产纤维素酶能力最强,酶活力最高,CMCA与 FPA分别达195.46U/mL和 174.52U/mL。

与其它学者关于枯草芽孢杆菌产纤维素酶的研究相比,枯草芽孢杆菌 BS-05所产纤维素酶活力CMCA与之相当[10]或稍低[11],但其 FPA与 CMCA值相近,表明所产纤维素酶系中 C1酶组分与 Cx酶组分较均衡,具有更广阔的应用前景。

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Study on the cellulase producing conditions of the Bacillus subtilis BS-05

TU Zong-ca i,JI ANG Guo-zhong,L IU Y i-dong,L IU Cheng-mei,ZHANG Qiu-ti ng
(State KeyLaboratory of Food Science and Technology,NanchangUniversity,Nanchang 330047,China)

Labora tory sc reening ce llulase p roduc ing bac te ria l s tra in BS-05was the p urp ose bac te ria l s tra in,the bes t cond itions for its p roduc tion of ce llulase was s tud ied.The exp e ri m ent results we re:2%CMC-Na as the ca rbon source,2%p ep tone and2%dus ty yeas t as the nitrogen source,the initia l fe rm enta tion m ed ium pH was ad jus ted to7,liquid volum e was60mL/250mL,inoculum s ize was5%,37℃,cultiva ted48h a t150r/m in.Unde r these cond itions,its enzym e p roduc ing ab ility was the s tronges t,in the c rude extrac t,ce llulose enzym e ac tivity was the highes t,ca rboxy m e thyl ce llulase CMCA ac tivity reached to195.46U/mL,filte r p ap e r enzym e ac tivity FPA reached to174.52U/mL.

Bac illus sub tilis;ce llulose;enzym e p roduc ing cond ition;op ti m iza tion

TS201.2+5

A

1002-0306(2010)05-0181-04

2009-10-28

涂宗财(1965-),男,博士,教授,博士生导师,研究方向:食品资源的开发利用。

教育部长江学者和创新团队发展计划项目(I RT0540)。