青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氢酸的HPLC分析

李登超

(淮阴师范学院生命科学学院,江苏淮安 223300)

青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氢酸的HPLC分析

李登超

(淮阴师范学院生命科学学院,江苏淮安 223300)

建立了青霉素酰化酶制备光学纯β-苯丙氨酸(BPA)过程中各成分的 HPLC分析方法。用 Zorbax XDB-C18柱在流动相为含 35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸缓冲液(含 SDS 0.68g/L),流速为 1.0mL/min,柱温 30℃,检测波长为 210nm等条件下,四种物质苯乙酰胺、BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸可以被有效分离,且在≤0.2mg/mL浓度下,四种物质含量与出峰面积均呈良好的线性相关。用 Chirobiotic T和 Chirobiotic R手性柱分别对手性物质N-苯乙酰-BPA和BPA的对映异构体进行了分离检测,并确定了最佳的洗脱条件。

青霉素酰化酶,β-苯丙氨酸,光学纯,高效液相色谱法

光学纯β-苯丙氨酸 (BPA),具有重要的生物和医学用途,如酶抑制剂[1]和β-抗生素[2],抗癌药物紫杉醇的侧链是羟基化的 BPA,侧链对紫杉醇发挥抗癌作用是不可缺少的[3]。近年来,用生物法制备光学纯BPA及其衍生物的研究备受青睐。青霉素酰化酶(PGA,EC.3.5.1.11)是在青霉素 G钾盐裂解成 6-氨基青霉烷酸(6-APA)和侧链羧酸过程中起关键作用的酶,在医药工业广泛应用其水解酶特性生产6-APA[4],而且 PGA还具有酰化酶的特性[5-8]。我们在利用 PGA酰化酶特性拆分外消旋BPA时,发现PGA能专一性地酰化一种对映体,另一对映体形式不被酰化,通过进一步分离纯化得到两种不同光学活性的BPA[9]。但在酰化反应过程中涉及到四种物质,即两种底物BPA和苯乙酰胺,两种产物 N-苯乙酰-BPA和苯乙酸。由于四种物质都具有苯环结构,在紫外区都有光吸收,而且苯乙酰胺和BPA都含有-NH2,因此,很难用常规的显色方法来定量检测其中任何一种物质的含量,进而影响到对反应过程的分析。另外,BPA和N-苯乙酰-BPA都是手性物质,具有对映异构体,所以建立分离两种物质对映异构体的方法对定量调控反应过程和分析产物的光学纯度显得尤为重要。因此,本文尝试利用高灵敏度的HPLC对其进行分离检测,建立 HPLC分析方法,以期为相关领域的研究提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

BPA标准品 Sigma公司;BPA、N-苯乙酰-BPA实验室自行合成,经色谱鉴定其纯度分别大于99%和 98%;其他试剂 均为市售分析纯。

Zorbax XDB-C18柱 4.6mm ×250mm,5μm, Agilent;Chirobiotic T手性柱 4.6mm×250mm,5μm, ASTEC;Chirobiotic R手性柱 4.6mm×150mm,5μm, ASTEC;0.45μm水相和有机过滤膜 上海源聚生物科技有限公司;1100series高效液相色谱仪Agilent;THX-05温度控制仪,XT4A显微熔点仪, WZZ-1S自动旋光仪等。

1.2 实验方法

1.2.1 四种物质的分离检测 反应过程反应液中各组成的含量分析通过装有 XDB-C18柱的Agilent 1100系列HPLC液相色谱系统。流动相为含35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸缓冲液 (含 SDS 0.68g/L),流速为 1.0mL/min,柱温 30℃,检测波长为 210nm。

1.2.2 标准曲线绘制 准确配制 2mg/mL的 BPA、N-苯乙酰-BPA、苯乙酸和苯乙酰胺母液,分别取 0、0.1,0.2、0.3、0.4、0.5、1mL母液于 10mL容量瓶中,用双蒸水定容,微膜过滤。上样量 10μL,用 XDB-C18柱按照上述方法进行 HPLC分析检测,以峰面积为纵坐标,以四种物质的浓度为横坐标,分别制定了标准曲线,在 0.2mg/mL浓度以下,四种物质的峰面积与浓度成很好的线性相关(图 1)。

图 1 HPLC测定四种物质的标准曲线图

1.2.3 N-苯乙酰-β-苯丙氨酸的对映体含量分析通过装有 Chirobiotic T手性柱的 Shi madzu LC-10Avp液相色谱系统。流动相为 35%乙腈和 65%20mM磷酸缓冲液(pH 5.5),流速为 1.0mL/min,柱温 20℃,检测波长 210nm。

1.2.4 β-苯丙氨酸的对映体含量分析 通过装有Chirobiotic R手性柱的 Shi madzu LC-10Avp液相色谱系统。流动相为甲醇∶醋酸∶三乙胺 =100∶0.4∶0.1,流速为 0.4mL/min,柱温 10℃,检测波长 254nm。

2 结果与分析

2.1 XDB-C18柱检测四种物质的图谱

采用安捷伦 Zorbax XDB-C18柱,7mmol/L pH3.0缓冲盐(含 0.68g/L SDS),分别用含乙腈 30%、35%、40%的流动相进行四种物质分离检测。当流动相中的乙腈含量为 30%时,能将苯乙酰胺、苯乙酸、N-苯乙酰-BPA、BPA完全分开,出峰时间分别为 3.7、6.8、12.5、26.5min;当乙腈含量为 35%时,四种物质的出峰时间分别为 3.2、5.2、7.6、10.7min,分离度均大于1.5,都能完全分开;进一步提过乙腈含量为 40%,由于出峰时间太快,N-苯乙酰-BPA、BPA的出峰时间重叠,不能分开。因此确定流动相组成为含35%(v/v)乙腈的 7mmol/L pH 3.0磷酸缓冲液 (含SDS 0.78g/L)。典型的四种物质的 HPLC分离图谱如图2所示。

图 2 XDB-C18柱分离检测四种物质的色谱图Ⅰ.苯乙酰胺;Ⅱ.苯乙酸;Ⅲ.N-苯乙酰-BPA;Ⅳ.BPA

2.2 Chirobio tic T手性柱分离消旋的 N-苯乙酰-β -苯丙氨酸

由表 1可知,在流动相比例为甲醇∶醋酸缓冲液=20∶80(v/v)时,分离度最高;但由于 pH偏高和流速较大等原因,S-和R-构型的N-苯乙酰-BPA出峰时间都较早。图 3显示了不同 pH对消旋的N-苯乙酰-BPA分离的影响,可以看出,当 pH=5.5时,色谱图的基线平稳,峰形对称,分离效果较好。因此确定最佳洗脱条件:甲醇∶醋酸缓冲液 (pH5.5)=20∶80 (v/v),流速 0.5mL/min,检测波长 210nm、温度 20℃。在此条件下两种构型的N-苯乙酰-BPA实现了完全分离,分离度为 1.89。N-苯乙酰-(S)-BPA和N-苯乙酰-(R)-BPA的出峰时间分别为 9.4、10.7min。

表 1 不同甲醇∶醋酸缓冲液比例对消旋N-苯乙酰-BPA分离度的影响

图 3 不同 pH对消旋N-苯乙酰-BPA分离图谱的影响洗脱条件:甲醇∶醋酸缓冲液 =20∶80(v/v),流速 0.5mL/min,检测波长 210nm、温度 20℃。

2.3 Chirobio tic R手性柱分离消旋的β-苯丙氨酸

Berthod等报道[10],用手性柱 Chirobiotic T以甲醇∶水 =40∶60的流动相能将 R-和 S-BPA完全分开,分离度为 1.9,但是我们利用此类柱,按照此文献提供的方法和检测条件并没有将两种构型的 BPA分开,通过改变流动相的组成和比例,也没有将其完全分开。后来改用 Chirobiotic R手性柱,在流动相组成为甲醇∶醋酸∶三乙胺 =100∶0.4∶0.1(by vol.),流速0.4mL/min,温度 10℃,检测波长 254nm的洗脱条件下,两种对映异构体实现了基本分离,R-和 S-型BPA的出峰时间分别为 13.5、15.0min,分离度 1.44 (图 4)。

图 4 Chirobiotic R手性柱分离消旋的β-苯丙氨酸

3 结论

PGA在酰化制备光学纯BPA的反应过程中,涉及到四种物质BPA、苯乙酰胺、N-苯乙酰-BPA和苯乙酸,其中 BPA和 N-苯乙酰-BPA又各有 R-和S-两种构型。本文建立的 HPLC方法在 12min内实现对四种物质的分离检测;12min和 18min内实现对BPA和N-苯乙酰-BPA两种异构体的分离检测。在最佳洗脱条件下苯乙酰胺、苯乙酸、N-苯乙酰-BPA、BPA的出峰时间分别为 3.2、5.2、7.6、10.7min;S-和R-型N-苯乙酰 -BPA的出峰时间分别为 9.4、10.7min。R-和 S-型 BPA的出峰时间分别为 13.5、15.0min。该法可以对反应过程实时定量监控和对手性物质进行光学纯度分析,从而为相关领域的研究奠定方法基础。

[1]Achilles K,Schir meister T,Otto H H.β-Lactam derivatives as enzyme inhibitors:1-peptidyl derivatives of 4-phenylazetidin-2-one as inhibitorsof elastase and papain[J].Arch Phar m Pharm Med Chem,2000,333(8):243-253.

[2]Nagano Y,Ikedo K,FujishimaA,et al.Pyloricidins,novel anti -Helicobacter pylori antibiotics produced byBacillus sp[J].J Antibiot,2001,54(11):934-947.

[3]Kingston D G I.Taxol,a molecular for all season[J].Chem Commun.,2001,20(10):867-880.

[4]Shewale J G,Deshpands B S,Sudhakaran V K,et al. Penicillin acylase:applications and potentials [J].Process Biochem,1992,27(3):131-143.

[5]Bruggin K,Roos E C,Devroom E.Penicillin acylase in the industrial production ofβ-lactam antibiotics[J].Org Process Res Dev,1998,2(2):128-133.

[6]Khimiuk A Y,Korennykh A V,Van Langen L M,et al. Penicillin acylase-catalyzed peptide synthesis in aqueous medium:a chemoenzymatic route to stereoisomerically pure diketopiperazines[J].Tetrahedron:Asymmetry,2003,14(20): 3123-3128.

[7]Fadnavis N W,Sharfuddin M,Vadivel S K.Resolution of racemic 2-amino-1-butanol with immobilized penicillin G acylase[J].Tetrahedron:Asymmetry,1999,10(23):4495-4500.

[8]Chilov G G,Moody H M,BoestenW H J,et al.Resolution of (R,S)-phenylglycinonitrile by penicillin acylase-catalyzed acylation in aqueousmedium[J].Tetrahedron:Asymmetry,2003, 14(17):2613-2617.

[9]LiD C,Cheng SW,Wei D Z,et al.Enzymatic production of enantiomerically pureβ -phenylalanine by acylation using penicillin G acylase from Escherichia coliin aqueous medium [J].BiotechnologyLetter,2007,29(12):1825-1830.

[10]Berthod A,Liu Y B,Bagwill C,et al.Facile liquid chromatographic enantioresolution of native amino acids and peptides using ateicoplanin chiral stationary phase [J].J ChromatogrA,1996,731(1):123-137.

Analysis of optically pureβ-phenylalanine produced by penicillin G acylase through HPLC

L IDeng-chao
(School ofLife Sciences,Huaiyin Teacher College,Huaian 223300,China)

Feas ib le HPLC m e thods we re deve lop ed to m easure som e comp ounds in reac tion of op tica lly p ure β-p henyla lanine(BPA) p roduced by p enic illin G acylase.Foursubs tances,i.e.p henylace tam ide,BPA, N-p henylace tyl-BPA and p henylace tic ac id could be de tec ted effec tive ly us ing Zorbax XDB-C18colum n unde r the follow ing elution cond itions:m ob ile p hase was7mm ol/L p hosp hate(pH3.0),containing acetonitrile35% (v/v) and SDS0.68g/L,1mL/m in flow ra te w ith de tec tion wave leng th210nm.W hen a ll the ir concentra tions we re unde r 0.2m g/mL,contents of four subs tances had good linea r corre la tion w ith the ir own p eak a rea.Enantiom e rs of t wo chira l comp ounds,i.e.N-p henylace tyl-BPA and BPA could be de tec ted unde r the op ti m um e lution cond itions us ing Chirob iotic T and Chirob iotic R colum ns,resp ec tive ly.

p enic illin G acylase;β-p henyla lanine;op tica lly p ure;HPLC

TS207.3

A

1002-0306(2010)05-0368-03

2009-04-02

李登超 (1976-),男,讲师,研究方向:生物化工。