市售鲫鱼体内菌株及其抗生素耐药性分新

侯进慧,高兆建,蔡 侃,叶 骏

(徐州工程食品(生物)工程学院,江苏徐州 221008)

市售鲫鱼体内菌株及其抗生素耐药性分新

侯进慧,高兆建,蔡 侃,叶 骏

(徐州工程食品(生物)工程学院,江苏徐州 221008)

分离健康鲫鱼体内菌株,通过显微镜观察和 16S rDNA分析对菌株进行鉴定,并进行产纤维素酶和淀粉酶菌株筛选。分离到的菌株分别属于假单胞菌、气单胞菌、希瓦氏菌等。在美国国家生物信息中心NCB I Genbank基因库中提交了其中两个菌株 16S r DNA序列,登录号是:FJ796224和 FJ796225。筛选到多株产淀粉酶菌株,其中产酶活性较高的菌株命名为Aeromonas veroniiF2。在鲫鱼肠道没有筛选到产纤维素酶菌株。抗生素检测分析显示,鲫鱼体内抗卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素三种药物的细菌有 11.29%,显示鲫鱼体内菌株抗药性比从田野环境中获得的菌株高 5～6倍,这需要引起人们的关注。

鲫鱼,细菌,16S rDNA,耐药性

鱼类是人们重要的蛋白质类食物来源,为满足人们对优质食物蛋白质不断增长的需求,鱼源性食品生产迫切需要增加投入和提高产量,同时应该增加鱼类食品的相关研究。鱼类体内的细菌对于鱼类的加工保鲜过程是非常关键的,也常常是鱼肉腐败的主要微生物来源。同时,由于鱼类肠道菌是肠道微生态系统的主要组成部分,影响着鱼类消化、免疫、生长和发育等过程,研究鱼类肠道菌不仅对于食品加工储存过程有一定的启示,对监测鲜活鱼肉产品也可以提供资料参考。关于鱼类等动物肠道菌的研究主要涉及到肠道菌群的形成、结构和数量、生理功能以及影响菌群结构的因素、与益生菌的关系等方面[1-2]。对于鱼类肠道菌的研究中,人们经常关注肠道菌群的分析和肠道产酶菌的研究,在一些鱼类中已经有了相关的研究报道,此类研究在鲫鱼中报道较少[3-5]。肠道产酶菌产生的胞外酶类,比如纤维素酶和淀粉酶,可以起到辅助消化的作用,促进鱼类对食物营养的消化吸收。鲫鱼是我国重要淡水鱼类,也是人们日常鱼肉蛋白的重要来源。对于鲫鱼肠道细菌的分析,不仅可以使研究者掌握其肠道菌群的情况,也可以为研究食品质量检测、饲料添加剂等提供有价值的资料。本研究对市场销售供食用的鲫鱼肠道微生物进行分离和抗生素抗性分析,并采用现代分子生物技术对其中的微生物种类进行了分析鉴定,对一些产分泌性酶类的微生物进行了分析。

1 材料与方法

1.1 实验材料

本实验筛选到的菌株 分离自市场出售供食用的健康鲫鱼体内肠道组织;分析纯生化试剂、PCR反应引物 购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Taq DNA聚合酶、dNTP等分子生物学试剂 购自天根生化科技 (北京)有限公司;培养基[6-7]LB (Luria-Bertani)培养基:胰蛋白胨 10g,酵母膏 5g, NaCl 10g,去离子水定容至 1L,灭菌备用,每 1L固体LB培养基中需再加入 12g琼脂粉;产纤维素酶菌株筛选培养基:羧甲基纤维素 10g,蛋白胨 10g,酵母膏5g,KH2PO41g,MgSO40.2g,NaCl 10g,葡萄糖 2g,琼脂12g,去离子水定容至 1L,灭菌备用;产淀粉酶菌株筛选培养基:可溶性淀粉 10g,蛋白胨 5g,酵母膏 10g,琼脂12g,蒸馏水100mL,去离子水定容至1L,灭菌备用;鲁哥氏碘液:将 6g KI溶解于 20mL蒸馏水中,再加入 4g碘充分溶解,去离子水定容至 1L,贮存于棕色瓶中备用。

1.2 产酶菌株筛选[6-7]

产纤维素酶菌株筛选:将 0.5%的刚果红倒入培养基中染色5min,倒掉刚果红后,使用 5%的NaCl溶液浸泡脱色 1h,若菌株周围有透明水解圈出现,则说明该菌株产纤维素酶。产淀粉酶菌株筛选:将卢哥氏碘液倒入平板中,若出现不能被染色的透明水解圈,则说明该菌株可产生淀粉酶。测量水解圈与菌落直径的比值初步确定产酶活性高的菌株。

1.3 菌株抗性检测

使用不同抗生素固体培养基,分析鲫鱼肠道菌株的抗药性。使用的抗生素及浓度分别是:卡那霉素 (30μg/mL)、氨苄青霉素 (50μg/mL)、氯霉素(30μg/mL)。

1.4 细菌基因组DNA提取

提取各菌株基因组DNA,作为 PCR反应模板[5]。

1.5 细菌 16S rDNA序列分析

用于扩增 16S r DNA序列的引物是:

F:AGAGTTTGATCCTGGCTCAG,

R:GGTTACCTTGTTACGACTT。

将各菌落 16S r DNA送至上海生工生物工程技术服务有限公司,由测序仪器 AB I PR IS M 3730进行测序。将获得的 16S r DNA序列提交NCB I网站,获得登录号。使用 BLAST程序在 GeneBank中进行序列比对,分析各产酶菌株的分类学地位,并分析筛选菌株与序列相近菌株的演化关系。

2 结果与讨论

2.1 分离鲫鱼肠道菌株

从鲫鱼肠道分离到 62株细菌,其中产淀粉酶菌株有26株,占总菌株的41.94%。分析获得产淀粉酶菌株的水解圈与菌落直径关系发现,菌株 F2的淀粉酶活性较高,达到 3.25倍。在鲫鱼肠道中没有筛选到产纤维素酶菌株。

2.2 菌株抗性

肠道菌株抗生素抗性分析结果显示,分离株菌中有 8株抗卡那霉素 (占 12.90%),有 18株抗氨苄青霉素(占 29.03%),有 7株抗氯霉素 (占 11.29%);抗两种抗生素情况是:抗卡那霉素和氨苄青霉素的菌株有 8株 (占 12.90%),抗卡那霉素和氯霉素有 7株 (占 11.29%),抗氨苄青霉素和氯霉素有 7株 (占11.29%);抗三种药物的菌株有 7株(占 11.29%)。

2.3 基因组DNA提取和 16S rDNA扩增结果

提取获得各菌株质量较高的基因组 DNA,将PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳分析显示,扩增出 F1、F2、F6、F14、F31、F40等菌株 16S r DNA片段,无明显杂带(图 1)。

图 1 16S r DNA电泳结果

2.4 16S rDNA测序分析和序列提交

通过测序确定各菌株 16S r DNA序列。使用BLAST程序将各序列在NCB I网站的比对结果显示: F1序列 (781bp)与 Aerom onas m ediastrain 480a的16S核糖体序列相似性是 100%;F2序列(1348bp)与Aerom onas veroniistrain 457c的 16S核糖体序列相似性最高,达到 99%;F6序列 (965bp)与 Aerom onas hydrophila的 16S核糖体序列相似性最高,达到99%;F14序列 (1404bp)与 Aerom onas veroniistrain 457c的 16S核糖体序列相似性是 100%;F31序列(655bp)与 Shewanella putrefaciensCN-32的 16S核糖体序列相似性是 100%;F40序列 (548bp)与Pseudom onas sp.bf-1的 16S核糖体序列相似性是100%。已将 F2和 F14的序列提交到美国国家生物信息中心 NCB I基因数据库中,序列号分别是: FJ796224和 FJ796225。菌株 F2和 F14比较分析结果如图 2,显示出两菌株均属于气单胞菌属。

图 2 F2的 16S rDNA序列分析结果

3 结论

本文对市场上出售的食用鲫鱼肠道菌株进行了分析,并对其中产分泌性纤维素酶、淀粉酶的菌株分别进行了筛选。结合分子生物学方法对一些菌株进行分类分析后,确定了它们的分类地位,并将获得的菌株 16S r DNA序列提交到了美国国家生物技术信息中心的基因库中。实验结果显示,所分析的鲫鱼体内微生物分别是属于假单胞菌、气单胞菌、希瓦氏菌等类别的细菌。对于筛选到的菌株分析显示,其中有 41.94%的菌株可产生淀粉酶,但未筛选到纤维素酶菌株。抗生素抗性检测结果显示,鲫鱼体内细菌中,抗生素抗性菌株较多,其中有 11.29%的菌株可以抗卡那霉素、氨苄青霉素和氯霉素三种抗生素,显示鲫鱼体内菌株抗药性比从田野环境中获得的菌株高 5～6倍,这一结果应该引起人们足够的重视。细菌的耐药性会导致病原菌防治难度加剧,其长期结果是导致感染性疾病的防治困难加大,对人类的健康造成严重危害[8]。食品中抗生素抗性菌株,特别是抗多种抗生素的菌株过多,很可能是在鱼类饲养过程中接触或注射了过多抗生素的结果。从食品安全角度考虑,现在应该对养殖鱼类限制使用抗生素,防止细菌的多种药物耐受性现象的继续增加。在鱼类或肉类食品安全方面,需要关注抗生素的危害,在检测方面也需要关注抗生素残留的检测。检测鱼类肠道菌群的抗生素抗性,为我们分析鱼类食品饲养过程中抗生素滥用情况提供了一种分析途径。

[1]宋增福,吴天星 .鱼类肠道正常菌群研究进展[J].水产科学,2007,26(8):471-474.

[2]文钰,杨汝德 .猪源双歧杆菌的分离纯化及初步鉴定[J].现代食品科技,2007,23(4):11-13.

[3]陈惠源,蔡俊鹏 .尼罗罗非鱼肠道淀粉酶高产菌株的筛选及耐酸、耐高温特性的研究 [J].水产科学,2005,24(10): 25-27.

[4]尹军霞,张建龙,沈文英,等 .鱼食性与肠道菌群关系的初步研究[J].水产科学,2004,23(3):4-6.

[5]李莉 .草鱼肠道菌群的变化和免疫机能的关系[D].华中农业大学,2003.

[6]张应玖,朱学军,关键,等 .一种新型淀粉酶的鉴定及其产酶菌株的筛选[J].微生物学通报,2002,29(5):38-41.

[7]齐云,陈飞,袁月祥,等 .一株能分解纤维素的高温耐碱放线菌[J].应用与环境生物学报,2003,9(3):322-325.

[8]侯进慧 .大肠杆菌的AcrAB-TolC多药外排泵及其调控研究进展[J].微生物学通报,2008,12:1932-1937.

Analysis of bacterial strain from Carassius auratus sold in m arket and its drug resistance

HOU Jin-hui,GAO Zhao-jian,CA I Kan,YE Jun
(Food Engineering(Bioengineering)Department,Xuzhou Institute of Technology,Xuzhou 221008,China)

In this p ap e r,bac te ria l s tra ins we re isola ted from hea lth Ca rass ius aura tus.The s tra ins we re c lass ified w ith m ic roscop es and16S rDNA ana lys is,ce llulase and am ylase p roduc ing s tra in we re se lec ted.The isola ted s tra ins we re Pseudom onas,Ae rom onas,Shewane lla.Two16S rDNA sequences we re subm itted to NCB I Genbank and access ion num be rs we re FJ796224and FJ796225.Seve ra l s tra ins p roduced am ylase and a bac te ria l s tra in w ith highe r am ylase ac tivity was Ae rom onas ve ronii F2.No s tra in w ith ce llulase ac tivity was found.Antib iotic res is tance ana lys is revea led tha t11.29%of the bac te ria from Ca rass ius aura tus we re kanam yc in,amp ic illin and chlorom yce tin res is tant s tra ins,which was5to6folds highe r than s tra ins from fie ld environm ent,the result should be p a id sp ec ia l a ttention.

Ca rass ius aura tus;bac te rium;16S rDNA;d rug res is tance

TS254.1

A

1002-0306(2010)05-0202-03

2009-06-24

侯进慧(1980-),男,博士,讲师,研究方向:食品生物技术。

校引进人才科研启动项目;校科研项目(XKY2008110)。