应用二次回归正交旋转组合设计优化转谷氨酰胺酶作用的乳清蛋白交联条件

胡慧玲,唐善虎,,＊,杨蓉生,袁 伟

(1.成都理工大学材料与化学化工学院,四川成都 610059; 2.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

应用二次回归正交旋转组合设计优化转谷氨酰胺酶作用的乳清蛋白交联条件

胡慧玲1,唐善虎1,2,＊,杨蓉生2,袁 伟2

(1.成都理工大学材料与化学化工学院,四川成都 610059; 2.西南民族大学生命科学与技术学院,四川成都 610041)

考察了 pH、催化时间、催化温度及加酶量对转谷氨酰胺酶作用WPI形成交联产物的粘度影响,并对影响因素进行优化,找出最佳组合。该研究共分两个实验进行,实验 1考察 pH、时间、温度及加酶量单个因素对转谷氨酰胺酶交联作用的影响;实验 2是基于单因素实验结果,采用四因素(pH、催化时间、催化温度、加酶量)五水平回归正交旋转设计,对WPI经转谷氨酰胺酶交联后产生最大粘度的最佳条件进行优化,以便确定实验多元回归方程和获得较大WPI黏度的最佳条件。实验结果表明:交联时间 4h、交联温度 50℃、pH8.0和加酶量 20u/g时,具有最佳粘度值,转谷氨酰胺酶作用效果最佳。

转谷氨酰胺酶,乳清分离蛋白(WPI),粘度,二次回归正交旋转组合设计

乳清蛋白是从乳清中回收获得的,是营养最全面的一种天然蛋白质。多数乳清蛋白产品的蛋白质效价(PER值)约 3.1,高于酪蛋白的 PER值(2.5),仅次于鸡蛋清的 PER值 (3.9)[1]。然而,乳清蛋白除持水性较好外,热稳定性、起泡性和流变学等特性在食品工业应用中存在很大的局限性[2-3]。通过改性,可以显著改善乳清蛋白的功能特性,如热稳定性、热凝胶特性、乳化特性等[4]。Sullivan等人 2004年的研究表明,乳清浓缩蛋白经变性、均质、乳化、酸化、发酵后通过核磁共振 (NMR)检测与分析,可以提高乳清浓缩蛋白的持水能力[5]。2008年 Zheng等人通过响应面设计优化用碱性蛋白酶水解乳清浓缩蛋白条件的研究,通过对 pH、温度、酶/底物浓度三个因素的控制,碱性蛋白酶水解乳清蛋白能够明显降低α-lactalbumin(a-La)和β-lactoglobulin(β-Lg)的抗原性[6]。乳清蛋白的改性方法有化学改性、物理改性和酶改性,酶改性主要包括水解和交联[7]。转谷氨酰胺酶(Transglutaminase,E.C.2.3.2.13)能催化酰基转移反应,从而在蛋白质,多肽以及伯胺之间导入共价键。如果蛋白质中赖氨酸残基的ε-氨基作为酰基受体,可在分子间以及分子内形成ε-(γ-Glu)-Lys键[8]。乳中蛋白质经转谷氨酰胺酶改性后,可以提高其乳化性、热稳定性;改善其粘度、凝胶强度等流变学特性,提高其在可食性膜制备等方面的应用[9]。乳清蛋白的粘度、热凝胶性等流变学特性在食品工业应用中存在很大局限性,也是食品工作者急需解决的难题,目前对酶改性后的乳清蛋白形成交联产物的粘度变化尚未见报道。本研究旨在考察 pH、催化时间、催化温度及加酶量对转谷氨酰胺酶作用WPI形成交联产物的粘度影响,同时应用二次回归正交旋转组合设计对影响因素进行优化,找出最佳因素组合,为工业生产及科学研究等操作提供参考[10]。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

转谷氨酰胺酶 (TG-H) 江苏一鸣精细化工提供;乳清分离蛋白粉 美国哥伦比亚公司,蛋白含量大于 90%;DTT(二硫苏糖醇) 购于Merck公司;其它试剂 均为分析纯。

Centrifuge 5804R冷冻离心机 德国 eppendorf公司;流变仪 美国 Brookfield公司;DELTA320pH计 瑞士METTLER TOLEDO公司;HH数显恒温水浴锅 金坛市金城国盛实验仪器厂;电子天平。

1.2 实验设计

1.2.1 单因素实验设计 分别考察交联时间 X1(1、2、4、8、16h)、催化温度 X2(35、40、45、50、55、60℃)、反应 pH X3(6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)和加酶量 X4(20、30、40、50、60u/g)对转谷氨酰胺酶 (TG-H)交联乳清分离蛋白(WPI)溶液的粘度影响。

1.2.2 四因素二次回归正交旋转组合设计 根据单因素实验结果,固定WPI浓度为6%,选择交联时间、pH、交联温度和加酶量四个因素作为研究对象,取实验中效果较好的水平作为各因素的零水平,确定各因素的间距,因素水平编码表见表 1。

表 1 响应面分析的因素和水平

1.3 实验方法

1.3.1 TG-H催化聚合乳清分离蛋白 准确称取乳清分离蛋白 6±0.01g,充分溶解于 100mL去离子水中,在 8000r/min,4℃下冷冻离心 10min,除去其中的杂质(包括矿物质、不溶性蛋白以及一些乳糖)。设定基础参数为温度 50℃,交联时间 4h,pH为 8.0, TG-H为20u/g,根据考察的单因素改变相应的实验参数。

1.3.2 交联后WPI粘度的测定 使用 Brookfield流变仪测试经 TG-H交联后的WPI的粘度,选用圆柱型零号转子,在 25±0.1℃室温下,测定转度为20r/min,剪切率为 24.6s-1下测定,每个样品重复测定三次[11]。粘度公式为:

其中:η表示在流体中取两面积各为 1m2,相距1m,相对移动速度为 1m/s时所产生的阻力,单位泊 (poise)或者厘泊 (cP)[11],1cP=1×10-3Pa·s= 1mPa·s。

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 交联时间对WPI粘度的影响 TG-H可催化不同来源的蛋白,相对而言,乳清蛋白不是 TG-H的很好底物。为了达到实验目的,需要对乳清蛋白进行处理[8]。本实验对乳清分离蛋白进行预热处理

(80℃,15min),之后加入一定量还原剂 DTT (20mmol/L)。在不同时间条件下 TG-H交联 WPI所得粘度结果见图 1,随着 TG-H催化交联时间的延长,WPI粘度开始时增大,在交联 4h时粘度达到最大,交联 4h后,随着交联时间的延长,WPI粘度反而减小。这是因为交联 4h后,随着时间的延长,合成的生物聚合物分子量会进一步增大,形成超大聚合物而沉淀下来,从而降低WPI溶液粘度值[11]。

图 1 交联时间对WPI粘度的影响

2.1.2 pH对WPI粘度的影响 由图 2可知,pH在5～7时 TG-H催化WPI的粘度变化不是很明显,当pH在 7～9时,粘度变化值明显,当 pH超过 8时, TG-H催化后的WPI粘度开始下降,这是因为酶的活力受 pH的影响极为显著,不同酶具有不同的最适pH,在最适 pH下,酶的活性最高,催化交联效果最好。由图 2所示,TG-H催化WPI存在一个最佳 pH范围,约在 8左右,这与赵金和张睿[12]研究认为转谷氨酰胺酶的最适 pH范围为 7.0～9.0是相符合的。

图2 pH对WPI粘度的影响

2.1.3 温度对 WPI粘度的影响 由图 3可知,在35～50℃之间,粘度随催化温度升高而增大,当温度超过 50℃时,TG-H催化交联WPI的粘度开始下降,这是因为 TG-H催化WPI聚合有一个最适温度范围。王金水等人[13]报道转谷氨酰胺酶最适作用温度为 50～55℃。该实验结果表明,TG-H催化WPI粘度达到最大时的温度为 50℃左右,这与王金水等人报道的结果相符合。

图 3 温度对 TG-H交联WPI粘度的影响

2.1.4 加酶量对WPI粘度的影响 一般来说,酶/底物值越大,越有利于酶完全地催化底物。当底物浓度一定时,加酶量会存在一个临界值[13]。由图 4可知,当加酶量在 20～30u/g,粘度值随加酶量增加而升高;当加酶量在 30～40u/g时,粘度值随加酶量增加而降低,可见在该实验条件下 30u/g加酶量是酶催化聚合的临界加酶量。酶对底物的催化量与催化效率是相互矛盾的,有关这一点可以明显地从图中看出,底物浓度固定,加酶量越多,催化效率越低。对于一个催化反应,需要综合考虑此二者的关系,在保证达到最大粘度值的条件下,尽可能地提高催化效率,本实验最佳加酶量可选 20～30u/g。

图 4 加酶量对 TG-H交联WPI粘度的影响

2.2 四因素二次回归正交旋转组合设计实验结果

2.2.1 实验设计表和实验结果 根据回归计划R436R0C[10],编制实验设计表,并将实验结果列入表 2。各种组合处理的 WPI溶液的粘度在 1.61～4.05mPa·s。

2.2.2 回归方程的建立与检验 对实验结果进行统计分析,得到影响乳清分离蛋白粘度 (η)的回归方程:

其模型与单因素实验效果相同,为进一步确定各因素对交联后乳清分离蛋白粘度的影响程度,对所得的数学模型进行方差分析,其结果见表 3。

粘度值大于 3.07mPa·s的 105个方案中的各个因素分布见表 4。对回归方程进行显著性检验:F1= MS回归/MS剩余=6.47>F0.05(14,21),说明得到的回归方程显著,实验数据与采用的数学模型相符合,不需要改变数学模型。进行失拟均方与误差的 F值检验:F2=MS失拟/MS误差=2.81

表 2 响应面分析设计及结果

表 3 回归旋转组合设计实验方差分析表

3 结论

3.1 由单因素实验得到转谷氨酰胺酶交联 6%乳清分离蛋白 (WPI)溶液的最佳粘度条件为:交联时间为 4h,交联温度为 50℃,pH为 8.0,酶的添加量最佳范围为 20～30u/g,考虑到酶的来源及经济因素,选择添加量为 20u/g。

3.2 采用二次回归正交旋转组合设计对转谷氨酰胺酶交联乳清分离蛋白 (WPI)的工艺条件进行研究,在交联时间、温度、pH、加酶量之间建立的二次回归数学模型为:由该模型模拟所得的粘度值与单因素实验效果是基本一致的。

3.3 本研究实现了乳清分离蛋白在经转谷氨酰胺酶交联后的粘度值的较大提高,在未经改性前 6%WPI的粘度值为 1.61mPa·s,改性后的 6%WPI粘度值可高达 4.05mPa·s,在食品材料研究和开发中具有一定的应用潜力。

[1]赵晶,张睿 .微生物谷氨酰胺转胺酶对乳清蛋白的改性[J].中国乳品工业,2004,32(2):36-40.

[2]韩雪,孙兵 .乳清蛋白的功能特性及应用[J].中国乳品工业,2003,31(3):28-30.

[3]赵国华,王雅茜,陈宗道 .乳清蛋白改性综述[J].中国乳品工业,1998,26(4):29-32.

[4]刘晶,韩清波 .乳清蛋白的特性及应用 [J].食品科学, 2007,28(7):535-537.

[5]Meng G T,Ma C Y.Fourier-transfor m infrared spectroscopic study of globulin from Phaseolus angularis(red bean)[J].Int J BiolMacromolecules,2001,29:287-294.

[6]Zheng H,Shen XQ,Bu GH,et al.Effects of pH,temperature and enzyme-to-substrate ratio on the antigenicity ofwhey protein hydrolysates prepared by Alcalase [J].International Dairy Journal,2008,18:1028-1033.

[7]Allen E,Jack P,Davis,Matthew K,et al.Advances in modifying and understanding whey protein functionality[J]. Trends in Food Science and Technology,2002,13:151-159.

[8]唐传核,杨晓泉,彭志英,等 .微生物转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白聚合研究[J].中国乳品工业,2002,30(6):11-15.

[9]黄志良,宁正祥 .转谷氨酰胺酶对乳蛋白质的改性作用[J].食品工业科技,2002,23(3):77-79.

[10]杨德 .实验设计与分析 [M].北京:中国农业出版社, 2002:239-241.

[11]Cony G,Joana T C,Paulo J,et al.Cross-linking of milk whey proteins by transglutaminase[J].Process Biochemistry, 2008,43:788-794.

[12]赵晶,张睿 .微生物谷氨酰胺转胺酶对乳清蛋白的改性[J].中国乳品工业,2004,32(2):36-40.

[13]王金水,赵谋明 .转谷氨酰胺酶的性质、制备及在食品加工中的应用[J].中国调味品,2005,319(9):9-13.

[14]阚建全 .食品化学 [M].北京:中国农业大学出版社, 2002:240-243.

Opti m ization ofwhey protein cross-linking via transglutam inase using quadratic regression rotational com binational design

HU Hui-ling1,TANG Shan-hu1,2,＊,YANG Rong-sheng2,YUANW ei2
(1.College ofMaterial and Chemistry&Chemical Engineering,Chengdu University of Technology,Chengdu 610059,China; 2.College ofLife Science&Technology,SouthwestUniversity forNationalities,Chengdu 610041,China)

The ob jec tives of this s tudy was to inves tiga te the influence of pH,ca ta lytic ti m e,ca ta lytic temp e ra ture and am ount of transg lutam inase on W PI c ross-linking and the changes of viscos ity of the p roduc t,and to op ti m ize the fac toria l com b ina tions.Two exp e ri m ents we re conduc ted.In exp e ri m ent1,effec ts of pH,ti m e,temp e ra ture or enzym e am ount of ind ividua l fac tor on c ross-linking we re inves tiga ted.In exp e ri m ent2,four fac tors(pH,ca ta lytic ti m e,ca ta lytic temp e ra ture,enzym e am ount)w ith five leve ls we re a rranged w ith orthogona l rota tiona l des ign based on the s ing le-fac tor tes t results.Viscos ities we re m easured and da ta we re ana lyzed w ith m ulti p le reg ress ion.The exp e ri m enta l results showed tha t a t pH8.0,50℃,add ition of20u/g of transg lutam inase,and c ross-linking for4h, had the op ti m a l viscos ity.

transg lutam inase;whey p rote in isola te;viscos ity;quad ra tic reg ress ion rota tiona l des ign

TS201.2

A

1002-0306(2010)05-0188-04

2009-08-10 ＊通讯联系人

胡慧玲(1984-),女,硕士研究生,研究方向:食品生物技术及其应用。

四川省科技支撑计划(07NG111-002)。