聚邻氨基苯甲酸/纳米金复合膜电化学免疫传感器用于水体中大肠杆菌的检测

符 莹，张新爱，滕瑛巧，刘慧杰，张 文，金利通

（华东师范大学化学系，上海200062）

0 引言

大肠杆菌是水体污染程度的重要指示菌，是肠道中最普遍、数量最多的一类细菌。当大肠杆菌由粪便尤其是肠道病患者粪便或医院污水污染的水源排放后,它可引发伤寒、痢疾、霍乱等肠道疾病流行[1]。存在于溪流、河水、湖泊等与人类生活密切相关的环境中的大肠杆菌已经成为人类病原存在的一个重要指标，是环境保护、食品卫生、饮水卫生和流行性病学领域中最重要的研究对象之一。因此，水体中大肠杆菌的检测研究对环境卫生以及流行病学等方面都具有十分重要的意义[2～4]。

大肠杆菌的传统检测方法包括多管发酵法、滤膜法、荧光法、生物检测法等。这些方法准确度高，但是存在检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点，已经不能满足现代检测需要。电化学免疫传感器具有简单、灵敏、快速等独特的优点，近年来受到了人们的广泛关注[5～6]。该文发展了一种具有低耗、高灵敏度、高选择性等特性的电化学免疫传感器实现了对水体中大肠杆菌的快速检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI 660电化学分析系统(CHI,美国)；S4800型扫描电子显微镜(SEM，Hitachi,日本)。

多克隆E.coli抗体 (北京宝赛生物科技有限公司,中国)；辣根过氧化酶标记的大肠杆菌抗体(ab20425,Abcam,英国)；大肠杆菌菌种(华东师范大学生命科学学院，中国)；其余试剂如牛血清白蛋白(BSA,Sigma,美国)等均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水，所有实验均在室温下操作。

1.2 免疫传感器的制备

玻碳电极(抛光后)分别在-0.10～1.35 V 电位下和 1.0 mmol/L HAuCl4溶液中，-0.04～0.93 V 电位下和50 mmol/L邻氨基苯甲酸溶液中进行循环伏安扫描制得poly-o-ABA/AuNP修饰电极，然后在此电极上滴加10 μL新配制的0.40 mol/L 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺基 (EDC)和0.10 mol/L N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合溶液并活化 40 min。 PBS 淋洗后，加入 10 μL 100 μg/mL的大肠杆菌抗体，用10 μL 1.0 mol/L乙醇胺和10 μL 1.0%BSA来封闭未结合的羧基以避免非特异性吸附。再加入10 μL大肠杆菌标准溶液，温育1 h。 最后，将 10 μL 100 μg/mL 辣根过氧化酶标记的大肠杆菌抗体滴加在电极表面反应1 h，用PBS清洗。

1.3 测试方法

三电极系统中以甘汞电极为参比电极，铂丝电极为辅助电极，研制的免疫传感器为工作电极。电极在5.0 mL 1.0 mmol/L对苯二酚溶液中，以-0.40 V～1.00 V 的电位范围进行循环伏安扫描，电流稳定后加入 50 μL 0.48 mol/L 的 H2O2，通过响应电流的大小来检测大肠杆菌的浓度。

2 结果与讨论

2.1 修饰电极的扫描电子显微镜(SEM)图谱表征

图1为poly-o-ABA/AuNP修饰电极的SEM图谱。可以观察到聚邻氨基苯甲酸的纤维和多孔结构以及分布于其中的金纳米粒子[7]。

2.2 修饰电极的电化学阻抗谱(EIS)表征

图1 poly-o-ABA/AuNP修饰电极的SEM图Fig.1 Scanning electron micrograph of poly-o-ABA/AuNP modified GCE

由图2知：相对于裸玻碳电极，AuNPs修饰电极的阻抗明显减小，说明AuNPs有效地促进了电子的传递。而poly-o-ABA修饰电极的阻抗明显增大，表明poly-o-ABA的导电性比较差，阻碍了电子的传递[8～9]。在图2的曲线d中，poly-o-ABA/AuNP修饰电极的阻抗介于纳米金与聚邻氨基苯甲酸之间。依次加上大肠杆菌抗体、大肠杆菌、辣根过氧化酶标记的抗体后，阻抗值逐渐增加，证明大肠杆菌抗体、大肠杆菌和辣根过氧化酶标记的抗体均被固载到poly-o-ABA/AuNP修饰电极上[10～12]。

2.3 免疫传感器上酶的电化学行为

图3为在免疫传感器中分别加入10 μL大肠杆菌抗体和10 μL辣根过氧化酶标记抗体并培养1 h，再放入10 mL 1.0 mmol/L对苯二酚的PBS溶液，检测得到循环伏安图 (a)。加入1.6 mmol/L的H2O2后，(b)中响应电流增加，显示出明显的电催化过程。

2.4 大肠杆菌的检测原理

图4为poly-o-ABA/AuNP免疫传感器的工作原理。反应体系包括典型的夹心免疫反应过程和特异性反应的电化学检测。该传感器在1.0 mmol/L对苯二酚存在下，通过辣根过氧化酶催化底物H2O2实现了对大肠杆菌的检测。

2.5 实验条件的优化

该实验研究了H2O2浓度对电流响应的影响。由图5知：在1.0 mmol/L对苯二酚存在的条件下， 当 H2O2浓度在 0.0至 4.8 mmol/L范围内时，响应电流与H2O2浓度呈线性关系。所以在免疫检测中，选择4.8 mmol/L的H2O2作为检测底液的浓度。

图2 (a)裸玻碳电极；(b)AuNPs玻碳电极；(c)poly-o-ABA玻碳电极；(d)poly-o-ABA/AuNP玻碳电极;(e)抗体/poly-o-ABA/AuNP玻碳电极；(f)大肠杆菌/抗体/poly-o-ABA/AuNP玻碳电极；(g)辣根过氧化酶标记抗体/大肠杆菌/抗体/poly-o-ABA/AuNP 玻碳电极在 10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-(0.010 mol/L pH7.0 PBS,0.10 mol/L KCl)中的电化学阻抗谱Fig.2 EIS of different electrodes in the presence of 10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-solution(0.010 mol/L pH7.0 PBS,0.10 mol/L KCl):(a)bare GCE;(b)AuNPs modified GCE;(c)poly-o-ABA modified GCE;(d)poly-o-ABA/AuNP modified GCE;(e)anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE;(f)E.coli/anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE;(g)HRP-anti-E.coli/E.coli/anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE

图3 在免疫传感器中加入(a)1.0 mmol/L对苯二酚;(b)1.0 mmol/L 对苯二酚和 1.6 mmol/L H2O2的循环伏安图Fig.3 Cyclic voltammogram of HRP-anti-E.coli/E.coli/anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE containing(a)1.0 mmol/L hydroquinone;(b)1.0 mmol/L hydroquinone and 1.6 mmol/L H2O2

考察了该传感器在 pH5.5到 pH8.5的范围的检测底液中对大肠杆菌的检测，结果表明在pH7.0时响应电流最大，因此选择7.0为检测的最优pH值。反应时间是影响催化反应的一个重要因素，响应电流随免疫反应的时间的增加而增大，实验中在60 min时达到平衡，所以选择培养时间为60 min。

2.6 免疫传感器对大肠杆菌的检测

由图6知，免疫传感器检测大肠杆菌的线性范围为 1.0×103～1.0×107cfu/mL，线性回归方程为I(μA)=-0.38+0.22logcE.coli。 对 于 浓 度 为 1.0×104cfu/mL的大肠杆菌，每组数据测定三次，RSD为4.5%，检测限为2×102cfu/mL。

2.7 选择性实验

在大肠杆菌(1.0×104cfu/mL)溶液中，加入枯草杆菌(1.0×105cfu/mL)、酵母菌(1.0×105cfu/mL)、放线杆菌(1.0×105cfu/mL)作为干扰物，用相同的实验步骤考察免疫传感器对大肠杆菌的响应电流。实验结果显示响应电流没有显著增加,表明该免疫传感器具有良好的选择性。

2.8 河水中大肠杆菌的检测

将 1.0 L 的河水用孔径为 0.45 μm 的滤纸过滤，富集得到的大肠杆菌溶液溶解于5.0 mL PBS(0.1 mol/L,pH7.4)中，运用该实验中的方法对大肠杆菌进行检测，结果显示大肠杆菌的浓度为50 cfu/mL，与平板计数法(52 cfu/mL)得到的结果一致。

图4 基于poly-o-ABA/AuNP修饰玻碳电极的免疫传感器工作原理Fig.4 Schematic of the amperometric immunosensor based on poly-o-ABA/AuNP modified GCE

图5 H2O2浓度对辣根过氧化酶标记抗体修饰的poly-o-ABA/AuNP修饰电极的影响(a)0.4 mmol/L;(b)0.8 mmol/L;(c)6.0 mmol/L的H2O2在基底中的电流响应，插图为响应电流与H2O2浓度的线性图Fig.5 Response currents of HRP-anti-E.coli/poly-o-ABA/AuNP modified GCE in(a)0.4 mmol/L;(b)0.8 mmol/L;(c)6.0 mmol/L H2O2;Insert shows the calibration plot between the response current and H2O2concentration

图6 (a)0.0 cfu/mL;(b)1.0×103cfu/mL;(c)1.0×105cfu/mL 的大肠杆菌在免疫传感器上的电流响应；插图为响应电流与大肠杆菌的浓度对数的线性关系图Fig.6 Response currents of the immunosensor toward the(a)0.0 cfu/mL;(b)1.0 ×103cfu/mL;(c)1.0×105cfu/mL of E.coli.Insert shows the calibration plot between the response current and the logarithmic value of E.coli concentration

3 结论

该实验采用poly-o-ABA/AuNP制备出新型的免疫传感器，并将其应用于河水中大肠杆菌的检测。该传感器检测河水中的大肠杆菌具有灵敏度高、选择性好的优点，在饮用水和食品安全检测等方面有很好的应用前景。

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