基于卟啉衍生物的荧光分子探针研究进展

方正辉，靳 珍，万其中*，张晓兵

(1.岳阳职业技术学院,湖南岳阳414000)（2.湖南大学化学化工学院,化学/生物传感与计量学国家重点实验室,湖南长沙410082）

0 引言

荧光分析法具有较高的灵敏度，一般比分光光度法高2～3个数量级，且具有选择性高，方法简便，取样量少等优点，近年来得到迅速发展。可用于测定的无机物、有机物、生物物质和药物等数目剧增，使荧光分析越来越成为分析工作者必须掌握的一种重要的分析手段[1]。

卟啉化合物广泛存在于自然界的生命体中，如血红蛋白、肌红蛋白、叶绿素、维生素B12、细胞色素P-450等物质都具有卟啉骨架结构。卟啉(Porphyrin)是卟吩(Porphine)外环带有取代基的同系物和衍生物的总称。卟吩是由4个吡咯环和4个次甲基桥联起来的18π电子的大环共轭结构，具有平面分子结构和芳香性，不同的卟吩分子其平面性不同，共轭程度也不同。其结构见图1中的化合物1。从图中可以看出，其结构具有以下几个特点：1）卟吩分子中4个吡咯环的8个β位和4个中位(meso-)的氢原子均可被其它基团所取代，生成各种各样的卟吩衍生物，即卟啉[2]。2）当卟吩环中的两个吡咯上的氢原子被金属离子取代时，形成金属卟啉，现在卟啉几乎与所有的金属离子都能形成配合物，因此，配合物的种类繁多。3）卟啉是两性化合物，其中两个吡咯环上的氮原子可接受质子，又可以给出质子。4）卟吩的骨架是非常容易变形的，其分子构型与四个中位(meso-)的取代基有关。卟吩由于没有取代基而近于平面结构，而四取代的卟啉，与其分子平面呈现出不同程度的偏离，如四苯基卟啉（化合物2）。卟啉若与较大的金属离子形成配合物后，则本来为平面的大环将会发生扭曲。由于卟啉化合物具有上述的光物理特性，它的激发和发射波长均在可见光区，具有较高的摩尔吸光系数，其分子结构易于修饰，且具有较大的Stokes位移，这有利于减少荧光背景的影响[3～4]，而且金属卟啉又表现出不同于卟啉的荧光性质，因此，卟啉类化合物已在荧光传感领域得到了广泛的应用[5]。

图1 卟啉的分子结构Fig.1 Structure of porphyrin

1 卟啉探针用于生物分子的检测

卟啉是生物体内血红蛋白、细胞色素和酶的辅基，具有特殊的生物活性，因此能与氨基酸、核酸和蛋白质等生物大分子相互作用。已有报道卟啉已成功用于部分DNA、RNA、蛋白质和氨基酸的检测。1996年，Takahata小组[6]利用有些生物分子能把没有荧光的金属卟啉中的金属离子拉出来而发出卟啉荧光现象检测L-半胱氨酸和谷胱甘肽。在这个基础上，Yang等[7]利用一个组氨酸可以络合两个锌卟啉的性质，巧妙设计了一个锌卟啉-芘复合物。利用加入组氨酸前后，分别表现为芘的单体和二聚体荧光性质的不同实现了组氨酸的检测。钯卟啉在除氧条件下能嵌插到双链DNA的GC富集区后，室温下磷光增强，与时间分辨技术联用，可作为DNA检测探针[8]。Gurrieri小组[9]在1999年成功地研制出了检测DNA分子的新方法，他们把水溶性的四磺酸基卟啉阴离子通过静电作用与带正电的聚赖氨酸组装成超分子体系，在组装的过程中，卟啉的荧光大大猝灭，而当有DNA存在时，带负电的DNA分子把卟啉置换出来，使体系荧光恢复。光谱法研究四氨基苯基卟啉和四甲基吡啶基卟啉与核酸的作用表明，卟啉与核酸摩尔比(R)大于0.25时，由于超螺旋结构的形成，核酸对卟啉的Soret带有减色效应、对荧光有熄灭效应，并增强四氨基苯基卟啉的共振光散射信号，但对四甲基吡啶基卟啉的共振光散射无影响；而当R小于0.25时，则生成新的荧光复合物[10]，利用此作用，可测定DNA和RNA。2008年，杨荣华等[11]利用钴卟啉能够与自由基卟啉形成基态复合物而能够猝灭其荧光而加入能够与钴卟啉强相互作用的蛋白质又能破坏这种复合物的原理，成功用于牛血清蛋白和人血清蛋白的检测。

2 卟啉探针用于气体小分子的检测

卟啉自由碱具有很强的荧光，而金属卟啉的荧光却相对较弱，但恰恰由于金属的引入，使很多含氮、氧、硫等气体小分子能从卟啉平面的上下两个方向与卟啉环中的金属形成络合物，减弱金属与卟啉的相互作用，从而使卟啉的荧光逐渐恢复，因此可以利用卟啉荧光恢复来检测气体小分子。目前已有报道卟啉荧光探针可用于氧气、氯化氢、二氧化碳、一氧化氮、二氧化氮、氨气等气体的检测。2001年，Richardson等[12]利用溶胶-凝胶技术包裹四取代卟啉化合物成功实现了对NO2的检测，与多层LB膜固定方法相比，该方法灵敏度增强了1 400%。杨荣华等[13]报道了全-(2,6-二-O-异丁基)β-环糊精对固定于PVC膜中的meso-四(4-甲氧基苯基)卟啉(TMOPP)有明显的荧光增强效应，且该荧光可被溶液中的CO2可逆猝灭。TMOPP受紫外光照激发后能发出紫色荧光，但与水溶液中CO2作用后形成不发荧光的配合物。在pH为9.0条件下与空白溶液和CO2水溶液接触后的发射荧光光谱(423 nm激发)显示，随着CO2溶液体积分数的增加，敏感膜的荧光强度逐渐减小，可用于CO2含量的测定。Amao[14]小组把四(五氟苯基)铂卟啉固定到聚三氟乙基甲基丙烯酸酯膜中来测氧，该探针不仅响应快速，且稳定耐用。环境要求空气中氯化氢气体的体积分数应在5×10-6以下，因此，对荧光探针检测限要求较高，目前，检测空气中氯化氢的荧光探针已经取得较大进展。主要采用烷氧基四苯基卟啉和羟基四苯基卟啉作为检测氯化氢的荧光探针。质子化卟啉的荧光性质与自由碱卟啉差别很大，利用这个现象，发展了基于卟啉的氯化氢气体荧光探针，1995年Nakagawa[15]把卟啉固定到亲酯性的硅树酯中，制成了对氯化氢气体响应的荧光探针。Baron[16]和Smith[17]也做过类似的工作，成功地检测了大气中氯化氢气体的含量。

3 卟啉探针用于阳离子的检测

荧光法在灵敏度、选择性、检测下限、以及响应时间等方面都远远优于光度法，而且不同金属离子对不同自由碱卟啉的荧光猝灭程度相差较大，因此，基于卟啉的金属阳离子荧光探针得到了广泛的研究。1964年，Fack[18]根据金属卟啉络合物在Soret带附近摩尔吸光系数可达3×105～5×105，预言了卟啉类化合物作为金属高灵敏试剂的应用前景。其后又有几个小组报道了用不同卟啉衍生物在不同条件下光度法测定Cu2+，Pb2+，Cd2+等[19]。即使在荧光法的应用较光度法广泛的今天，仍不时有一些基于卟啉分光光度法测金属离子的报导出现。

卟啉可以与金属阳离子配位形成金属卟啉。而且金属卟啉与自由碱卟啉的吸收光谱和发射光谱又完全不一样，因此，利用不同的卟啉化合物就能直接测定金属离子。翁彦琴等[20～21]分别设计了对称的四（4-二(2-吡啶基)氨基苯基）-锌卟啉和 5-（4-二(2-吡啶基)氨基苯基）），5，10，15-三（4-甲氧基苯基）锌卟啉。由于高浓度卟啉与金属卟啉能够自猝灭和二(2-吡啶基)氨基与Cu2+2∶1络合的特性，铜离子的加入使得荧光探针分子团聚形成网状或线状聚合物，锌卟啉荧光猝灭。张晓兵等[22]设计合成了一个新的卟啉二聚物，并首次将其用作测定Hg2+的光化学传感器的荧光载体，这种卟啉二聚体由于具有两个卟啉环而相对于单卟啉来说对汞离子有更好的荧光响应特性。该传感器对汞离子在较宽的线性范围内有响应，在较宽的pH范围内几乎不受pH的影响，在碱金属离子、碱土金属离子、及常见过渡金属离子存在下对汞离子有非常好的选择性。

文献中已有不少报道利用卟啉的金属化来检测金属离子，但是与开链配体相比，卟啉环的金属化过程比较慢。基于此，张晓兵等利用卟啉仅作为荧光团，设计并合成了含有2-（氧甲基）吡啶的化合物，用作锌离子荧光探针的研究。该探针在无催化剂条件下，通过荧光比率法实现对锌离子的检测[23]。荧光比率法是通过比较两个荧光发射峰的比率来实现对金属离子的检测的，这样有利于增加响应范围，减少环境因素的影响。2009年，张晓兵等[24]又设计合成了一个卟啉-萘酰亚胺杂交体的比率性荧光探针用于水相中Hg2+的检测及活细胞中Hg2+的荧光成像研究。探针的两个荧光基团具有相同的激发波长范围（410～420 nm），不同的发射波长，且两个荧光发射峰之间的位移较宽（125 nm），有效的避免了基于波谱移动的比率型探针常具有的发射峰波谱重叠的缺陷，特别适合用于生物样品（如细胞）中Hg2+比率型荧光成像研究。

时至今日，已有报道卟啉可以用于Zn2+、Cd2+、Li+、Cu2+、Na+、Co2+、Pd2+、Hg2+以及 H+的检测等。在荧光分析法越来越成熟的今天，人们研制出对更多金属阳离子有更高选择性和更低检测下限的荧光探针，并将其制作成简易传感器，用于实际样品检测分析。如今，人们多将这些荧光探针用于细胞中某种金属阳离子的检测，进一步与生物结合，逐渐实现在体内检测的现实意义。

4 卟啉探针用于阴离子的检测

金属卟啉中心络合的金属离子往往还能与阴离子形成络合物而使其自身的光学性质发生改变，基于这个原理分析工作者发展了很多测阴离子的探针，但是这些探针多是基于光吸收信号变化的[25～28]。卟啉环上含有丰富的氮原子，稍加修饰（如氮原子质子化）就可以对某些阴离子产生识别。1992年，Shionoya[29]设计合成了一种新型卟啉衍生物，他们用该衍生物作为荧光分子探针对F-进行检测，得到令人满意的结果。该文章通过设计合成一种与阴离子有强结合作用的卟啉衍生物，为卟啉在阴离子荧光探针方面的发展进行探索，为卟啉研究提出了一个新的方向。Zhang等[30]通过把四苯基卟啉质子化(H4TPP2+)就制成了对Cl-响应的荧光探针。Cl-的加入使651 nm的荧光强度降低，而使683 nm的荧光强度升高，通过拟合曲线，H4TPP2+与Cl-形成了1∶2的络合物。扩展卟啉有更大的空间和更多的有机胺基团，不需要质子化就可以直接对阴离子进行识别，在这个方面研究较多[31～32]，大部分还是基于光吸收信号变化。

5 卟啉探针用于中性物质的检测

四苯基卟啉由于自身不带特殊基团，因而与一些中性物质的作用较弱，所以直接用它来单独检测中性化合物是不现实的，但如果让它与一些大分子作用形成超分子体系，改变检测环境，增强卟啉对中性物质的荧光检测信号，从而实现卟啉化合物对一些中性分子的检测。2000年，杨荣华等[33]基于蒽与H2TPP之间的荧光能量转移现象，制备出高灵敏的单质碘荧光分子探针，该荧光探针比传统荧光探针的灵敏度提高近一倍。同年，他们[34]还研究了烷基化β-环糊精与H2TPP的包络作用，并研制了基于荧光增强的脂肪胺光化学荧光探针。后来他们[35]又以H2TPP为荧光载体研制了基于荧光增强的Tween-60光化学荧光探针，除Tween-80外，其它表面活性剂及离子对测量无干扰。2006年，李广涛教授小组[36]用小分子或大分子表面活性剂把一系列卟啉或金属卟啉成功掺杂到硅薄膜中并用于检测TNT、DNT等爆炸物的微量蒸汽。2007年，该组又利用溶胶凝胶化学和简单、低廉的电纺丝技术将卟啉掺杂纳米复合物制成了大比表面积、良好气体渗透性的荧光纳米纤维膜并实现了对微量爆炸物蒸汽的低浓度检测[37]。

6 结束语

综上所述，可以看出，卟啉化合物已在生物分子、气体小分子、阳离子、阴离子以及中性物质荧光探针方面得到很大发展。卟啉类化合物在荧光分析中的应用正处于快速的发展之中，前景喜人。当然，也还有不少工作有待今后研究，探索对更广泛的样品进行测定的可能性，研究其作为重金属离子、DNA荧光探针在临床分析中的实际应用等。可以期望，随着卟啉类衍生物的不断出现，其在荧光分析中的应用将会得到进一步的发展。

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