Bmi-1在黑色素瘤中的表达及其与p16相关性分析

尹利华 刘纯青 曾亮 孟秀香

1.湖南怀化医学高等专科学校医学检验系，湖南 怀化 418000；2.大连医科大学检验医学院，辽宁 大连 116044；3.湖南省肿瘤医院病理科，湖南 长沙 410013

黑色素瘤（malignant melanoma, MM）是来源于黑色素细胞的一种侵袭力强、转移性高、进展迅速且预后极差的高度恶性肿瘤。其发病率在近二十年中成倍增长［1］。多梳基因家族的Bmi-1被认为是一种原癌基因，参与细胞转化和肿瘤形成。现有众多实验数据显示Bmi-l在多种肿瘤中均有高表达［2-3］。但有关Bmi-l与黑色素瘤的研究较少。p16基因是近年发现的直接参与细胞生长增殖负调控的抑癌基因［4］。本研究旨在检测黑色素瘤组织中Bmi-1及p16蛋白的表达水平，及其与黑色素瘤临床病理特征的关系，并研究二者在黑色素瘤中表达的相关性。

1 资料和方法

1.1 临床资料 收集2003年—2007年期间湖南省肿瘤医院病理科保存的黑色素瘤石蜡标本35例，另选14例皮内痣样本作为良性对照。所有组织HE切片经两位病理医生读片（双盲法）以及HMB45、S-100蛋白免疫组织化学检测确诊。在35例黑色素瘤患者中，男性14例，女性21例；年龄18～83岁，平均51.1岁；有淋巴结转移12例，死亡7例；根据病理（Clark标准）分级：Ⅰ级7例，Ⅱ级7例，Ⅲ级4例，Ⅳ～Ⅴ级17例。皮内痣组男性4例，女性10例；年龄14岁～53岁，平均38.1岁。所有标本均经4%的甲醇溶液固定，常规石蜡包埋，4 μm厚做连续切片，室温保存。

1.2 试剂及方法 二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化处理，3%H2O2溶液消除内源性过氧化物酶，PBS缓冲液（pH7.4）洗片，柠檬酸缓冲液（pH6.0）抗原修复液常规修复：微波炉中750 W 12 min，冷却3 min，750 W 12 min加热以充分暴露抗原位点。待自然冷却后，加封闭液室温封闭30 min，分别滴加鼠抗人Bmi-1多克隆抗体（l∶100稀释液，Abcam USA）及鼠抗人P16单克隆抗体工作液（l∶150稀释液, Santa Cruz USA），4 ℃温育过夜。PBS缓冲液冲洗，分别加二抗（羊抗鼠，北京中杉公司SP试剂盒）37 ℃温育60 min，PBS缓冲液冲洗，滴加S-A/HRP液（北京中杉公司SP试剂盒），室温温育30 min，PBS缓冲液冲洗，用新鲜配置的DAB溶液显色。镜下控制反应时间，自来水终止显色，用苏木素复染细胞核，梯度乙醇脱水，中性树胶封片，显微镜下观察。实验分别用已知阳性组织切片作为阳性对照，用PBS代替2种一抗为阴性对照。

1.3 结果评定标准 免疫组织化学法染色阳性反应为显微镜下可见细胞质和(或)细胞膜、细胞核呈棕黄色。每张切片随机观察10个高倍镜视野，根据染色阳性细胞所占细胞的百分比及染色强弱程度，将结果分为：＜5%为(-)，6%～30%为(+)，31% ～60%为(++)，＞60%为(+++)，将(++～+++)定为中高表达，将(-～+)定为低表达。如果阳性细胞数达到标准，但染色强度较弱者，相应降低一级。以上结果至少由两位病理科医生在双盲情况下独立观片后统一所得。

1.4 统计处理 采用SPSS 16.0统计软件对数据进行处理，黑色素瘤与皮内痣组的组间差异采用卡方统计分析；Bmi-1与p16间的相关性采用Spearman相关性分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 Bmi-1和p16蛋白在黑色素瘤组织中的表达 免疫组织化学检测结果显示，Bmi-1和p16均主要表达在细胞核，表现为细胞核内呈现棕黄色或棕褐色颗粒，也有少量表达在细胞质。本组35例黑色素瘤中Bmi-1阳性表达率为63%（22/35），中高阳性表达率为51%（18/35），14例皮内痣中Bmi-1阳性表达率为71%（10/14），中高阳性表达率为14%（2/14）。可见Bmi-1蛋白在黑色素瘤组织中的中高阳性表达率明显高于皮内痣组（χ2=5.711，P＜0.05），而两组间的阳性表达率差异无统计学意义（χ2=0.056，P＞0.05）。p16在35例黑色素瘤中阳性表达为17%（6/35），中高阳性表达为6%（2/35）；14例皮内痣中p16阳性表达率为93%（13/14），其中中高阳性达71%（10/14）。可见p16蛋白在黑色素瘤中阳性及中高阳性表达率均明显低于皮内痣组（阳性率：χ2=24.15，P＜0.01；中高阳性率：χ2=19.93，P＜0.01）。

2.2 Bmi-1和P16蛋白表达与黑色素瘤临床病理征的关系 为观察临床各因素对Bmi-1及p16表达的影响，本研究分析了患者的性别、年龄、肿瘤体积大小、发病部位、淋巴结转移及病理分级与Bmi-1、p16的相关性。结果显示，p16与6个临床因素都无相关性，而Bmi-1的表达与病理分级关系密切，即Ⅲ、Ⅳ级黑色素瘤Bmi-1的阳性表达率（67%）明显高于Ⅰ、Ⅱ级黑色素瘤（29%）（P＜0.05)，但与其他5个因素则不存在明显的相关性（表1）。

2.3 黑色素瘤中Bmi-1蛋白表达与p16蛋白表达的相关性 Spearman相关分析结果显示，黑色素瘤组织中Bmi-1与p16表达无相关性（r=0.239，P＞0.05，表2）。

图1 黑色素瘤组织中Bmi-1、p16蛋白的表达Fig.1 Expression of Bmi-1 and p16 proteins in malignant melanoma tissues(SP×400)

表1 黑色素瘤组织中Bmi-1、p16蛋白的表达与临床病理特征的关系Tab.1 Correlation between the clinical pathologic features and the expression of Bmi-1 and p16 protein in malignant melanoma n(%)

表2 黑色素瘤组织中Bmi-1蛋白与p16蛋白的相关性Tab.2 Correlation of the expression of the Bmi-1 to p16 protein in malignant melanoma tissues

3 讨 论

Bmi-1是新近发现对细胞周期有负调节作用的癌基因，属于转录抑制因子polycomb家族。现已确定人类Bmi-1基因位于第10号染色体短臂1区3带（10p13），含10个内含子和10个外显子。编码含326个氨基酸的蛋白质，其蛋白质氨基酸序列与鼠的一致性达98%。现认为Bmi-1在细胞周期的负调控作用主要是通过调控其下游p16ink4a/Arf位点而进行的，该位点通过不同的启动子分别编码p16ink4a和p19Arf蛋白。Bmi-l即通过调节该位点编码的肿瘤抑制因子p16ink4a和p19Arf的表达来控制细胞的增殖和衰老。

本研究发现Bmi-1在黑色素瘤组织中的中高阳性表达较皮内痣组明显增强（51% vs 14%，P＜0.05），但中高阳性略低于Kim等［3］的研究结果，提示Bmi-1高表达与肿瘤的发生与进展关系密切。本研究结果采用卡方检验显示，Bmi-1 蛋白高表达率与患者性别、年龄、肿瘤大小、分布部位及是否淋巴转移无关（P＞0.05），而与病理分级相关，病理分级中的Ⅲ/Ⅳ期的患者Bmi-1蛋白表达高于Ⅰ/Ⅱ期患者（P＜0.05）。显示Bmi-1基因可能在黑色素瘤的发展、浸润转移过程中起到重要作用。提示有可能作为临床监测病情的一个重要指标。但本研究样本例数较少，临床资料不太完善亦可能对统计结果有影响，这需要本课题组在以后的研究中进一步完善。

有关Bmi-1在黑色素瘤中的表达目前存在不一致的证据。Mihic-Probst等［5］研究表明，与原发性黑色素瘤相比，转移性黑色素瘤Bmi-1表达显著增高（P=0.001）；而Bachmann等［6］研究显示，黑色素瘤中Bmi-1表达较良性组织下降，且Bmi-1缺失表达与肿瘤的侵袭性有关。本研究结果倾向于支持Mihic-Probst等［5］的结论，即Bmi-1在黑色素瘤中表达增高。本研究认为Bmi-1基因介入了黑色素瘤的发病机制，其高表达很可能起着促进肿瘤增殖的作用。

Mouriaux等［7］在脉胳膜黑色素瘤中发现60%的病例p16呈阴性表达，本研究显示黑色素瘤组p16阳性表达率及中高阳性表达率较皮内痣组明显降低（阳性率：17% vs 93%，P＜0.01；中高阳性率：6% vs 71%，P＜0.01）。p16蛋白高表达率与患者性别、年龄、肿瘤大小、分布部位、病理分级及是否淋巴转移无关（P＞0.05），提示黑色素瘤的发生可能与p16表达下降有关。近年有研究者将外源性p16基因转染p16基因缺失的肿瘤细胞，发现恢复p16的表达可抑制肿瘤细胞的生长［8］，这是p16抑制肿瘤生长的直接证据，也是证明p16缺失可诱发癌症的间接证据。因此，黑色素瘤中p16表达的降低，可减弱其对CDK4的抑制作用，进而促进肿瘤的生长。本研究对Bmi-1与p16在黑色素瘤中的表达作了相关性分析，结果发现两者并不存在相关性。

综上所述，由于p16的变异或不稳定表达可存在Bmi-1与p16不相关的情况，一方面提示p16的降低并不是由Bmi-1的高表达引起的，另一方面也说明Bmi-1可通过其他机制作用于肿瘤细胞。

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