甲状腺球蛋白基因多态性对甲状腺非髓样癌易感性的影响

李建国 柳晓义 王宇 胡建霞 曹明智

青岛大学医学院附属医院乳腺外科，山东 青岛，266003

甲状腺非髓样癌（non-medullary thyroid cancer，NMTC）起源于甲状腺上皮细胞，约占所有甲状腺癌的90%。主要包括乳头状癌和滤泡状癌，未分化癌和Hurthle细胞癌较少见。20%～25%的甲状腺髓样癌病例是家族性的，而NMTC家族遗传因素很少。

甲状腺球蛋白（thyroglobulin，Tg） 和促甲状腺激素受体（thyroid stimulating hormone receptor，TSHR）基因在非恶性甲状腺疾病中的作用已有报道，研究发现Tg基因的改变与甲状腺肿相关［1-4］，甲状腺肿在NMTC家系中出现频率较高，且是NMTC的已知危险因素［5］。Tg基因中A7589G序列改变是Q2511R多态性的基础［6］。TSHR是一种G蛋白偶联受体，结合促甲状腺激素后发挥促进滤泡细胞生长和分泌激素的作用。已有研究发现TSHR基因多态性改变与甲状腺增生和甲状腺肿瘤有关［7-8］。本研究通过对中国北方汉族人群Tg或TSHR基因多态性进行检测，来探讨甲状腺非髓样癌的易感基因。

1 资料和方法

1.1 资料 2004年6月—2008年6月期间，本院共收集NMTC住院患者176例（设为NMTC组），其中男性82例，女性94例，平均年龄（50.7±5.64）岁，所有患者均经病理诊断证实为NMTC。具体分为乳头状、滤泡状、Hurtle细胞或混合乳头状和滤泡状细胞癌。同时设置对照组184例，其中男性84例，女性100例，平均年龄（49.5±4.65）岁，均为在本院健康查体中心体检并经筛选的健康人群。

1.2 方法

1.2.1 外周血采集 NMTC组患者均抽取空腹外周血5 mL（术前、未化疗），对照组同样抽取空腹外周血5 mL，置于预先加入1 mL ACD抗凝剂的圆底离心管中，颠倒混匀，编号记录后放入-80 ℃低温冰箱中保存，3个月内提取DNA。

1.2.2 TSHR C253A多态性检测 ⑴基因提取：赛百盛基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA，溶解于pH 8.0的TE缓冲液中，-80 ℃低温冰箱中保存。⑵PCR扩增：根据GenBank中的基因序列用DNAstar软件设计上下游引物，上游引物5’-GCGATTTCGGAGGATGGAGAAATAGC-3’，下游引物5’-CCGGGTACTCACAGAGTCTGCGACCTG-3’［9］，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，PCR产物长度为227 bp。反应体系25 μL：去离子水13 μL，DNA模板（150～200 ng）2 μL，10×Buffer 2.5 μL，10×dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq酶 1 U。循环参数：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性60 s，57 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；之后72 ℃终止延伸5 min。⑶酶切鉴定反应体系：去离子水9 μL，10×Buffer 2 μL，PCR产物7 μL，Tth111Ⅰ 2 μL；37 ℃水浴中酶切过夜。⑷酶切结果的分析：限制性酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳（50 v，40 min）分离后观察结果。结果分析：TSHR C253A多态性检测，若为纯合变异，PCR扩增片断经Tth111Ⅰ酶切后（CCC/ACC），可产生201和16 bp 2个片断；当此位点为杂合变异型时，酶切后得到227、201和16 bp 3个片断。

1.2.3 Tg A7589G 多态性检测 ⑴基因提取：赛百盛基因组DNA提取试剂盒提取外周血DNA，溶解于pH 8.0的TE缓冲液中，-80 ℃低温冰箱中保存。⑵PCR扩增：根据GenBank中的基因序列用DNAstar软件设计上下游引物，上游引物5’-AACTCAGACAGTCTGGCTTCC-3’，下游引物 5’-CGACGCGGGCATCTGAGTCCT-3’，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR产物长度为240 bp。反应体系25 μL：去离子水13 μL，DNA模板（150～200 ng）2 μL，10×Buffer 2.5 μL，10×dNTP 2 μL，25 mmol/L MgCl21.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq酶 1 U。循环参数：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性60 s、58 ℃退火60 s、72 ℃延伸60 s，共35个循环，之后72 ℃终延伸5 min。⑶酶切鉴定反应体系：去离子水9 μL，10×Buffer 2 μL，PCR产物7 μL，TaqⅠ 2 μL。37 ℃水浴中酶切过夜。⑷酶切结果的分析：限制性酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳（60 v，30 min）分离后观察结果。结果分析：Tg A7589G多态性，若是纯合变异，PCR扩增片断经TaqⅠ酶切后，可产生186和54 bp 2个片断；当此位点为杂合变异型时，酶切后得到240、186和54 bp 3个片断。

1.3 统计处理 运用Hardy-Weinberg平衡法则检测样本的群体代表性，采用SPSS 11.0统计处理软件将实验数据进行χ2检验，并计算相对危险度和95%可信区间。以P<0.05作为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 TSHR C253A基因型与等位基因的频率分布 由于C/A多态性的纯合基因变异数量非常少，在数据统计时，本研究将杂合变异和纯合变异相结合。NMTC组CC基因型的频率为89.8%（158/176），CA+AA基因型的频率为10.2%（18/176）， 对照组CC基因型的频率为87.5%（161/184），CA+AA基因型的频率为12.5%（23/184）。NMTC组CA+AA基因型频率与对照组没有明显差异（χ2=0.46，P=0.497）。NMTC组A等位基因频率与对照组相比，差异无统计学意义（χ2=0.941，P=0.332）。TSHR C253A PCR产物及限制性酶切产物电泳结果见图1。

图1 TSHR C253A PCR产物及酶切产物电泳图Fig.1 Result of electrophoresis of the products of TSHR C253A in an agarose gel

2.2 Tg A7589G基因型与等位基因的频率分布 NMTC组AA基因型频率为17%(30/176)，AG基因型频率为53.4%（94/176），GG基因型的频率为29.6%（52/176）。对照组AA基因型频率为26.1%（48/184），AG基因型频率为54.9%（101/184），GG基因型的频率为19%（35/184）。NMTC组AG+GG基因型与对照组相比，差异具有统计学意义（χ2=4.333，P=0.037）。NMTC组A等位基因频率为43.75%（154/352），G等位基因频率为56.25%（198/352）。对照组A等位基因频率为53.5%（197/368），G等位基因频率为46.5%（171/368）。NMTC组G等位基因频率明显高于对照组（χ2=6.891，P=0.009）。2组复合数据的分析：与纯合性相关的ORs为1.55（95%CI: 1.1～2.3）。Tg A7589G PCR产物及限制性酶切产物电泳结果见图2。

图2 Tg A7589G PCR产物及酶切产物电泳图Fig.2 Result of electrophoresis of the products of Tg A7589G in an agarose gel

3 讨 论

TSHR是一种G蛋白偶联受体，与促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）结合发挥作用，是滤泡细胞生长和发挥功能的主要刺激因子。已经在家系研究中发现，TSHR的基因突变与甲状腺功能亢进和甲状腺增生症存在相关性［10］。TSHR C253A多态性导致了编码的氨基酸P52T的改变，此段氨基酸位于TSHR的胞外区。变异的蛋白质在52位置上缺少一个β旋转，这可能改变受体的三维结构，导致TSH作用的异常。

研究发现TSHR基因的变异与一些良性甲状腺疾病的高风险性相关。良性甲状腺疾病例如非毒性结节性甲状腺肿（multinodular goiter，MNG）是甲状腺非髓样癌的强烈危险因子，TSHR的突变可能直接与肿瘤形成有关［11］。这些突变通常引起受体信号的激活，可导致细胞的无限制生长。因此笔者认为该基因多态性可能与NMTC的高风险性相关。本研究中TSHR C253A的A等位基因在NMTC组和对照组中的分布没有明显差异（P<0.05），也可能与样本量小及抽样误差有关。

Tg是甲状腺中表达量最多的蛋白质，功能是甲状腺激素合成的支架及甲状腺激素和碘的储存蛋白。甲状腺肿在NMTC家系中较常见，且是人群中NMTC的危险因素［12］。

已有报道称循环中Tg的水平是NMTC发生的预兆，这表明两者之间可能存在一种因果关系［13］。本研究中Tg A7589G的G等位基因频率在NMTC患者中分布较多，NMTC组和对照组的等位基因频率差异有统计学意义。Tg A7589G可能通过一种功能性变异的线性失衡来调整发病危险度，多态性导致谷氨酸-精氨酸的转变，这个变异定位于甲状腺球蛋白的乙酰胆碱酯酶同源区。这个区的功能还不清楚，有证据表明这个区的突变与胎儿甲状腺肿有关［14］。而且，小鼠模型上这个区的突变导致了明显结构异常的Tg分子在内质网的蓄积，最终导致了先天性甲状腺肿和甲状腺机能亢进［15-16］。

研究数据表明Tg的遗传变异可能对NMTC危险度有直接作用或通过调整甲状腺肿的易感性来调整危险度。尽管NMTC危险度与G等位基因的相关性很微弱，但普通人群中R等位基因的高频率意味着其很有可能对NMTC肿瘤的发生率有着重要的影响。高加索人群中该等位基因的频率是50%，杂合性和纯合性变异存在于近1/3的患者。本研究中甲状腺球蛋白基因A7589G在NMTC组和对照组存在多态性，G等位基因可能为中国北方甲状腺非髓样癌发病的易感基因。

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