Sonic Hedgehog信号通路在肝细胞癌中的表达及意义

罗小军 孔宪炳 阎雄 周江山

重庆医科大学附属第一医院肝胆外科，重庆 400016

在哺乳动物中，Hedgehog（HH）信号通路主要由HH配体（Sonic hedgehog，Shh；Indian hedgehog，Ihh；Desert hedgehog，Dhh），2个跨膜蛋白受体Ptch和Smo，核转录因子Gli（Gli1、Gli2和Gli3）以及下游目的基因（Ptch、Gli1、WNT、EGF和Cyclins等）组成。HH信号通路在胚胎时期对组织分化及发育调节起了巨大作用，最近越来越多的研究显示，其激活能导致多种肿瘤形成，如基底细胞癌、髓母细胞瘤、前列腺癌、乳腺癌、肺癌、胰腺癌和胃肠道肿瘤等［1-3］，但Sonic Hedgehog（SHH）信号通路在肝癌中的作用国内报道尚不多。本研究旨在通过免疫组织化学和RTPCR法检测SHH信号通路中Shh、Gli2在人肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）细胞系和组织中的表达，研究Shh和Gli2表达与HCC临床病理之间的关系，探讨Shh和Gli2在HCC中的表达及其临床意义，为肝癌的防治研究寻求新的实验依据。

1 材料和方法

1.1 研究对象 收集2007年2月—2008年8月期间重庆医科大学附属第一医院收治的肝癌及肝内胆管结石手术切除患者的标本。所有患者均经病理确诊，肝癌30例，另外收集肝硬化患者标本20例，正常肝组织标本10例。30例肝癌标本中，男性23例，女性7例；年龄36～73岁，平均年龄52.7岁；肿瘤直径平均5.9 cm（2.1～13.0 cm），根据Edmondson分级标准分级：Ⅰ～Ⅱ 级17例，Ⅲ～Ⅳ级13例；伴有肝内门静脉侵犯12 例，无肝内门静脉侵犯18 例；肝癌伴有肝硬化17 例，肝癌无肝硬化13 例；肝癌伴乙肝阳性26 例，肝癌无乙肝阳性4 例；肝癌伴血清甲胎蛋白升高（＞25 ng/mL）22例，肝癌血清甲胎蛋白正常（≤25 ng/mL）8例。收集10例新鲜肝癌组织及癌旁肝组织标本（距离肝癌肿块5 cm以上），手术后立刻置液氮冻存。所有标本都经组织病理学确诊。人肝细胞肝癌细胞系HepG2、Huh7由重庆医科大学病理生理实验室惠赠。

1.2 试剂 兔抗人Shh、Gli2多克隆抗体购自武汉中美科技有限公司，兔抗人Smo多克隆抗体购自Abcam公司。SP试剂盒及DAB试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司。RNA提取试剂TRIzol购自天根生化科技公司，RT试剂盒购自TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 免疫组织化学检测 组织标本经4%甲醛溶液固定，石蜡包埋，常规制备切片。采用免疫组织化学SP法检测Shh和Gli2的表达，检测方法按试剂盒操作说明，切片常规脱蜡至水，滴加内源性过氧化物酶阻断剂37 ℃条件处理10 min，微波抗原修复；山羊血清封闭后，滴加一抗（Shh为1∶150稀释，Gli2为1∶100稀释，Smo为1∶50稀释）4 ℃过夜；生物素标记的山羊抗兔IgG 37 ℃反应30 min后，辣根过氧化酶标记的链霉卵白素37 ℃反应15 min，DAB显色，苏木精对比复染，脱水，透明，封固。

免疫组织化学检测结果判定标准：普通光学显微镜下每张切片随机选取5个高倍镜视野观察细胞，细胞质和（或）细胞核出现棕黄或棕褐颗粒为阳性细胞，根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占比例判定实验结果。根据染色程度的不同评分：无着色0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；按阳性细胞百分比：≤5%为0分，>5%～≤25%为1分，>25%～≤50%为2分，>50%～≤75%为3分，>75%为4分；两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0分为阴性（-），1～4分为弱阳性（+），＞4分为阳性（++～+++）。

1.3.2 RT-PCR法检测 Shh和Gli2 mRNA的表达 肝癌组织在液氮冷冻条件下，将标本组织研磨成粉末，趁液氮尚未完全挥发，每100 mg组织加1.0 mL TRIzol裂解液，吹打均匀，充分裂解后把液体转移到1.5 mL EP管中，加0.2 mL氯仿抽提RNA，再加等体积异丙醇沉淀RNA，最后用DEPC处理水充分溶解RNA。提取的总RNA经紫外分光光度计测定浓度，A260/A280比值在1.8～2.0，置-80 ℃保存备用。

人肝癌细胞株HepG2、Huh7培养于含10%小牛血清的RPMI1640培养液，置于37 ℃、CO2体积分数为5%的培养箱中培养。实验时选用对数生长期细胞（细胞数量5×106个），TRIzol法提取总RNA，按TaKaRa公司两步法试剂盒说明书进行RT-PCR检测。引物由上海生物工程有限公司设计合成，引物序列、产物大小如表1所示。PCR扩增体系25 μL，反应条件为：Shh 94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共34个循环；最后再72 ℃延伸 5 min；Gli2 94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共32个循环；72 ℃终延伸5 min。RT-PCR产物行琼脂糖凝胶电泳，数字成像系统拍照分析。

表1 Shh基因引物序列及产物大小Tab.1 Primers and fragment sizes of SHH signaling genes

1.4 统计处理 所有数据均采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，数据以表示，采用Fisher精确检验和单因素方差分析检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 免疫组织化学检测SHH信号通路表达的结果 30例HCC标本中，Shh、Gli2蛋白染色阳性率分别是63.3%（19/30）和66.7%（20/30）。Shh蛋白主要在细胞质中表达，呈棕褐色颗粒；Gli2蛋白在细胞核和细胞质中都有表达，呈棕黄色或棕褐色颗粒。检测结果显示，正常肝组织中无SHH信号通路蛋白Shh、Gli2的表达。在部分肝硬化组织中也检测到了SHH信号通路蛋白Shh、Smo蛋白的表达（图1）。

2.2 SHH信号通路蛋白的表达与HCC临床病理的关系 由表2可见Gli2蛋白表达与HCC肝内门静脉侵犯及肿瘤病理分级相关，差异有统计学意义（P＜0.05），在伴有肝门静脉侵犯和肿瘤组织低分化的HCC中Gli2蛋白高表达。Gli2蛋白表达与肿瘤大小、是否合并肝硬化及HBV感染无明显相关性。Shh蛋白表达与HCC各临床病理特征均无明显相关性。血清肿瘤标记物甲胎蛋白在临床中常用作为肝癌患者诊断和复发的重要指标，经检测显示血清甲胎蛋白与HCC中SHH通路蛋白Shh、Gli2的表达无明显相关（P＞0.05）。

2.3 RT-PCR检测肝癌组织和细胞系中SHH信号通路表达的结果 Shh、Gli2 mRNA在HCC组织表达率分别为60%（6/10）和70%（7/10），与免疫组织化学检测结果相一致。癌旁组织中Shh和Gli2 mRNA表达率为20%（2/10）、30%（3/10），Shh和Gli2 mRNA在HCC组织表达高于癌旁组织，差异有统计学意义（P＜0.05）。HepG2、Huh7细胞系均有Shh和Gli2 mRNA的表达。SHH信号通路在Huh7中表达高于HepG2，但两者间差异无统计学意义（P>0.05，图2，表3）。

图2 Shh、Gli2 mRNA在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达Fig.2 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines

表2 SHH信号通路蛋白的表达与HCC临床病理的关系Tab.2 Relationship between expression of SHH signaling protein and clinical features of HCC(n)

表3 Shh、Gli2 mRNA在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达Tab.3 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines( , n=10)

表3 Shh、Gli2 mRNA在肝癌组织和肝癌细胞系中的表达Tab.3 Expressions of Shh mRNA and Gli2 mRNA in HCC tissue and cell lines( , n=10)

*: Compared with adjacent-tumor tissues group; △: Compared with Huh7 group.

3 讨 论

在哺乳动物中，HH信号通路主要由Hedgehog配体（Shh、Ihh和Dhh）、2个跨膜蛋白受体Ptch和Smo、核转录因子Gli（Gli1、Gli2和Gli3）以及下游目的基因（Ptch、Gli1、WNT、EGF和Cyclins等）组成。当HH信号通路激活时，HH配体与Ptch结合，解除了Ptch对Smo的抑制效应，Smo进入细胞质激活下游转录因子Gli，诱导目的基因表达，进而调控细胞生长、增殖和分化。

原发性肝细胞肝癌的形成是多步骤、多阶段的过程，可能由多种基因参与，涉及多条信号通路，但发病机制目前仍不清楚。Sicklick等［4］在HCC中检测到SHH信号通路基因Shh、Ptch、Smo和Gli1高表达，说明HCC中存在SHH信号通路的表达。本研究结果发现Shh、Gli2蛋白在HCC组织中大量表达，而在正常人肝组织中无阳性发现，提示参与肝脏早期的胚胎发育及组织分化的SHH信号通路在肝癌中大量激活，可能参与肝癌的发生、发展［5-6］，而成熟的正常肝组织中无SHH信号通路表达［7］。SHH信号通路在肝癌细胞系HepG2、Huh7中存在表达，且在Huh7中表达高于HepG2，这种差异可能是由于SHH信号通路在不同肝癌细胞系中激活不同所致。

本研究在部分肝硬化组织中检测到SHH信号通路的表达，说明SHH信号通路不仅在肝癌中表达，而且SHH信号通路在肝硬化中也有激活。这与先前研究的在原发性胆汁性肝硬化病变和其他肝硬化组织中存在SHH信号通路的异常激活一致［4,8］。Huang等［9］在部分肝癌癌旁组织中检测到SHH信号通路表达，发现这些癌旁组织存在细胞分化不良甚至有微小癌灶，而其他分化良好的癌旁组织中则无SHH信号通路表达。由此说明，SHH信号通路的激活可能发生在HCC的早期阶段。

本研究进一步分析了SHH信号通路基因的表达与HCC肿瘤相关病理特征之间的关系。结果显示Gli2的表达在伴有肝门静脉侵犯和低分化的HCC组中明显高于在无肝门静脉侵犯和高分化的HCC组，提示Gli2的表达可能与肝癌的恶性程度相关。近来Kim等［10］采用反义寡核苷酸方法在肝癌中通过抑制Gli2基因的表达可以下调c-Myc、Bcl2和上调p27的表达，从而抑制肝癌细胞的生长，说明针对SHH信号通路的特异性靶向治疗将可能成为肝癌治疗的一条新途径。

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