香蕉茎叶中乳酸菌的分离和鉴定

徐绍成 杨 瑞 杨劲松

乳酸菌是指一群通过发酵糖类生产大量乳酸的细菌的总称，是革兰氏阳性菌、不形成芽孢(个别属除外)、不进行呼吸的球菌或杆菌，在发酵碳水化合物时主要的代谢产物为乳酸[1]。乳酸菌是促进青贮料发酵酸化成熟的有益菌群，为降低青贮损失，提高青贮品质，许多国家正研究使用乳酸菌添加剂。大量研究结果表明，乳酸菌具有调节肠道菌群平衡、抑制肠道致病菌定植、提高机体免疫力、改善机体营养状况等作用，因而在多个领域被广泛应用[2]。乳酸菌在自然界分布广泛，人、畜、禽肠道、许多食品、物料及少数临床样品中均有存在。本试验对自然界中的香蕉茎叶表面附着的乳酸菌进行分离,并对分离菌株性能进行了初步研究，从中筛选出性状优良的乳酸菌，为制备优良的青贮饲料专用发酵剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 试验材料

样品来源：从海南省中国热带农业科学院基地中采集样品。

培养基：MRS培养基，鉴定用培养基[3]。

主要设备：超净工作台、高压灭菌锅、恒温培养箱、PHS-2C精密酸度计、厌氧装置、显微镜。

1.2 试验方法

1.2.1 样品的制备

将采来的香蕉茎叶切碎，用四分法均匀称取10 g样品于90 ml无菌生理盐水中，振荡均匀，静置2 h，用移液管吸取1 ml，加入到装有9 ml无菌生理盐水的试管中，逐次稀释至 10-5，选择 10-3、10-4、10-5三个稀释度。

1.2.2 菌株的分离

分别取这3种稀释液0.1 ml，采用涂布法，用含10%CaCO3的MRS固体培养基进行分离，经37℃恒温厌氧培养48 h。挑取典型菌落，仔细观察菌落形态，同时进行革兰氏染色、油镜下观察菌体形态和接触酶试验。

1.2.3 乳酸菌属的鉴定试验

根据 R.E Buchanan（1984）、杨洁冰（1996）[4-5]介绍，凡是革兰氏阳性，过氧化氢酶试验阴性，在MRS培养基上菌落周围形成明显的透明环的所有分离菌，均初步定为乳酸菌。在确定为乳酸菌的前提下，进一步进行明胶液化试验、吲哚试验、H2S产生试验、pH值4.5生长试验、硝酸盐还原试验等来确定属的划分。

1.2.4 乳酸菌种的鉴定试验

根据凌代之等（1999）[6]介绍，乳酸菌种的鉴定主要是根据供试菌株对碳水化合物的发酵产酸试验，即通过对单糖、二糖、三糖、多糖以及糖苷和糖醇类等碳水化合物的利用情况来区分。

1.2.5 用于制作青贮饲料发酵剂的优良乳酸菌筛选试验

将分离并鉴定的3株乳酸菌分别按3%的接种量传入MRS液体培养基中，37℃恒温培养。每隔2 h测定不同菌株发酵液pH值，绘制的产酸速率曲线是不同发酵时间(h)所对应发酵液pH值的变化[7]。根据不同菌株的产酸能力以及产酸速率来筛选适宜用作青贮饲料的菌株。

2 结果与分析

2.1 菌落形态和细胞形态检测结果

经厌氧培养48 h后，观察菌落的形态和特征，分别挑取典型菌落且周围有碳酸钙透明圈的单菌落共5 株，分别命名为 HN1、HN2、HN3、HN4、HN5，革兰氏染色、菌落特征及细胞形态、大小、排列方式鉴定结果见表1。

从表1可以看出，从香蕉茎叶中分离的5株菌种中，HN4和HN5为G-，不符合乳酸菌特性。其余3株均为G+，菌落光滑、湿润，符合乳酸菌特性。对菌体形态和排列方式的观察可知，HN1菌株具有植物乳酸杆菌的形态学特征，HN2菌株具有短乳杆菌的形态特征，HN3具有乳酸片球菌的形态特征。

表1 5株菌的形态特征

2.2 乳酸菌的鉴定

2.2.1 杆菌HN1、HN2属种鉴定的结果

对初步筛选到的两株杆菌进行了进一步的试验鉴定，结果见表2、表3。

从表2、表3可见，所有菌种都能水解淀粉，KOH试验、接触酶试验、明胶液化试验、吲哚试验均为阴性，但对多种糖的利用情况不同。综合乳酸菌分类鉴定的文献资料，可将HN1株菌种初步确定为植物乳杆菌，HN2菌株确定为短乳杆菌。

表2 HN1、HN2生化试验结果

表3 HN1、HN2碳水化合物发酵产酸试验结果

2.2.2 球菌HN3属种鉴定结果（见表4）

由表4可知，HN3不运动，不产生吲哚，不还原硝酸盐，发酵葡萄糖不产气等，符合片球菌属的特征。在对各种碳水化合物的发酵试验中,HN3能利用木糖、海藻糖和核糖，因此，可初步判定HN3为乳酸片球菌。

表4 HN3菌株生理生化特征及糖发酵试验

2.3 产酸速率测定结果（见图1）

图1 不同菌株的产酸速率

如图1所示，在接入3%的接种量后，3株分别很快进入对数生长期，在前12 h，代谢速度都在加快，产酸量明显增加，pH值很快下降；在12～18 h的稳定期中，菌体产酸量明显减少，18 h后，产酸量几乎不再增加，pH值趋于稳定。其中植物乳杆菌HN1和短乳杆菌HN2两株菌株的产酸性能较好，HN1菌株的产酸能力最强，18 h左右pH值就能达到3.2，而HN2菌株在18 h后也能达到3.6。球菌HN3的产酸速率比较差。产酸速度是乳酸菌活力良好的重要特征之一，不同菌株间存在较大的差异。在青贮饲料制备过程中pH值的快速并且大幅度的降低能够显著抑制青贮玉米原料中的那些对青贮饲料品质有不良影响的微生物，如丁酸菌、丝状真菌、酵母及霉菌的生长，从而提高青贮饲料的品质。因此，植物乳杆菌HN1和短乳杆菌HN2可被用来制作优良的香蕉青贮发酵剂。

3 讨论及结语

本试验从海南热带农业科学院采集的香蕉茎叶样品中分离到3株乳酸菌，首先用传统的生理生化性质测定方法进行初步的种属鉴定，其中一株为植物乳杆菌，一株为短乳杆菌，还有一株为乳酸片球菌。

通过本试验分离到的3株乳酸菌产酸能力测定结果表明，HN1和HN2株菌的对数生长期较长，产酸性能较高，分别达到了3.2和3.6，而片球菌HN3产酸能力较差，这符合Nancy J.Gardner等（2001）片球菌在产酸能力上确实稍差于乳杆菌的试验结果[8]。本试验所分离菌株具有适应期短，对数生长期长，菌液pH值下降较快，产酸性能较高的特点；同时，具有耐高温，耐干旱等海南热带特色特点，上述特点表明，HN1和HN2菌株适合开发作为香蕉茎叶青贮饲料微生态制剂。

[1]朱丹宇,王英,周剑忠,等.酸马奶中乳酸菌的分离和鉴定[J].江苏农业科学,2009(1):245－246.

[2]刘文华,任慧英,邹玲,等.一株优良乳酸菌的分离鉴定与特性研究[J].中国畜牧兽医,2008,35(2):153－153.

[3]Jeppesen V F,Huss H H.Characteristics and Antagonistic Activity of Lactic Acid Bacteria Isolated from Chilled Fish Products[J].International Journal of Food Microbiology,1993,18:305－320.

[4]R.E Buchanan.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)[M].北京:科学出版社,1984：702－810.

[5]杨洁冰.乳酸菌生物学基础及应用[M].北京:中国轻工业出版社,1996：7－30.

[6]凌代之,东秀珠.乳酸细菌分类鉴定及实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.

[7]刘飞,杨丽杰,侯俊财,等.青贮饲料中优良乳酸菌的分离鉴定[J].江西饲料,2007(1):22－23.

[8]N J Gardner,T Savarda,P O bem eierb,et al Selection and characterization of mixed starter cultures for lactic acid fem entation of carrot cabbage,beet and onion vegetable mixtures[J].International Joumal of Food Microbiology,2001,64(3):261－275.