饲料中阿美拉霉素的含量检测研究

李 政 李 燕 陶兴无 余凤云

阿美拉霉素又称卑霉素、肥拉霉素。它是由绿色产色链霉菌 Tü57（Streptomyces viridochromogenes Tü57）发酵产生的正糖霉素族(orthosomycin)寡糖类多组分的抗生素[1]。难溶于水、吡啶、乙酸，易溶于丙酮、二氯甲烷等有机溶剂。其主要应用于畜牧业，作为饲料添加剂使用，能显著提高猪、肉鸡等动物的平均日增重和饲料报酬，市场应用前景广阔。目前国内研究多处于菌种选育阶段，未进行大规模生产。

在菌种选育过程中，好的筛选方法至关重要，而菌种发酵液抗生素产量的测定更是重中之重。目前国内所报道的阿美拉霉素的含量检测方法主要有高效液相法[2]和生物监测法[3-4]，但高效液相法成本较高，应用于菌种大规模筛选时很不划算，而生物监测法周期长，操作繁琐，受温度、湿度及操作人员等因素的影响，往往出现较大的误差。本实验室根据阿美拉霉素在212 nm处有较大吸收的特点，建立了以薄层-紫外分光光度计检测阿美拉霉素含量的方法，该法较为简单、快捷、准确，成本低，尤其适合于阿美拉霉素菌种的大量筛选及无高效液相条件下阿美拉霉素相关产品的含量检测。

1 实验仪器及试剂

uv-vis 8500型紫外分光光度计、eppendorf centrifuge 5417R台式高速冷冻离心机、254紫外分析仪、对照品(美国礼来公司提供)。

微量移液器、HF254硅胶板、展层缸、甲醇、二氯甲烷。

2 实验步骤及结果

2.1 对照品溶液的配置

精密称取干燥恒重的阿美拉霉素对照品50mg置于50 ml的容量瓶中，用甲醇溶解并稀释到刻度，制成1mg/ml的对照品溶液，储存备用。

2.2 供试品溶液的制备

阿美拉霉素是一种亲脂性寡糖类物质，在水中的溶解度极低，在发酵液中绝大部分存在于菌体的细胞周质空间。因此本实验室将发酵液离心后直接去上清液，60℃条件下将菌体干燥至恒重。取菌体粉末5 g置于50 ml的离心管中，加入10 ml二氯甲烷振摇提取30 min，离心取上清液储存备用。

2.3 阿美拉霉素波长的选择

精密吸取阿美拉霉素对照品溶液1 ml，以甲醇为稀释液稀释到20 μg/ml，以甲醇为空白对照，在uvvis 8500型紫外分光光度计上扫描吸收光谱图，扫描范围为180.0～400.0 nm，得知阿美拉霉素在212.0 nm和289.0 nm处有吸收峰，212.0 nm处吸收峰最大，则选择212.0 nm为测定波长，见图1。

2.4 标准曲线的绘制

以1mg/ml的阿美拉霉素对照品溶液为母液，精确配置浓度为 10、20、30、40、50、60 μg/ml的对照品梯度溶液。以甲醇为空白溶液，置于紫外分光光度计下，在212.0 nm处检测吸光度，以浓度（x）为横坐标，以吸光度（y）为纵坐标，绘制标准曲线。结果表明，阿美拉霉素在 10～60 μg/ml范围内线性关系良好，见图2。

图1 阿美拉霉素对照品波谱扫描图

图2 阿美拉霉素对照品曲线

2.5 阿美拉霉素提取液样品的薄层层析及含量测定

吸取阿美拉霉素供试品与对照品各20 μl，同时在一块HF254硅胶板上点样，以二氯甲烷：甲醇（9：1）为展开剂展开，Rf值约为0.4。将硅胶板吹干后，在254紫外分析仪下观察并画出有效斑点范围。用钢匙刮取上述斑点于容量瓶中，加4 ml的甲醇超声洗脱15 min，过滤，滤液于10 ml的容量瓶中，用甲醇定容。用标准曲线法测定吸光度并计算含量。

2.6 重复性实验

精密吸取供试品溶液20 μl点样于薄层板上，按2.5的方法于212.0 nm波长条件下连续测定5次吸光度，计算RSD值得0.74%，结果表明本方法重复性良好。实验结果见表1。

2.7 稳定性实验

精密吸取供试品溶液20 μl点样于薄层板上，按2.5 节的方法于 212 nm 波长条件下于 0、1、2、3、4、5、6 h测定吸光度，计算RSD值得0.85%。说明样品在6 h内吸光度稳定。实验结果见表2。

表1 重复性实验结果

表2 稳定性实验结果

2.8 加样回收率实验

在同一块硅胶板下端点样，第1个点点上已知阿美拉霉素含量的发酵液供试品20 μl，然后在第2个点点上已知浓度的对照液20 μl，第3、4、5个点先点上20 μl的已知阿美拉霉素含量的发酵液样品，再分别点上10、15、20 μl已知浓度的对照品，展层后按样品测定法测定各样品的吸光度，重复测3次，然后换算成含量，计算回收率。回收率=混合液的含量/(混合液含量+已知发酵液样品含量)。结果表明本方法回收率良好。实验结果见表3。

表3 加样回收实验结果

3 结果与讨论

本文首次提出用薄层-紫外分光光度法检测阿美拉霉素含量的方法适合于在实验室无高效液相条件下对阿美拉霉素发酵液及其样品的含量分析检测。鉴于目前国内阿美拉霉素菌种的产量还不高，大多数实验室还停留在高产菌株的筛选阶段，通过高效液相方法大规模的检测各个菌种的发酵产量，成本高，设备复杂，检测耗时长。本方法可以简便、快捷，相对准确地测定菌种发酵产量，且重复性、稳定性、回收率良好，尤其适合应用于阿美拉霉素高产菌的大规模筛选。

本方法容易受薄层厚度、均匀程度、点样量的准确性等因素影响，因此操作过程中要严格控制条件，方可保证较高的精确度。

[1]Weitnauer G,Mühlenweg A,Trefzer A,et al.Biosynthesis of the orthosomycin antibiotic avilamycin Adeductions from the molecular analysis of the avi biosynthetic gene cluster of Streptomyces viridochromogenes Tü57 and production of new antibiotics[J].Chem.Biol.,2001，8(6):569-581.

[2]张秀英.阿维拉霉素预混剂的含量测定[J].中国兽药杂志,2000,35(3):21-23.

[3]靳亮,童应凯,王泽立,等.卑霉素高产菌株的选育[J].中国抗生素杂志,2006,5(31):303-305.

[4]国家药典委员会.中华人民共和国药典二部 [M].2005年版.附录Ⅺ.