鸭多杀性巴氏杆菌外膜蛋白H基因的表达及抗原性鉴定

郭东春，孙 ,2，刘家森，姜 骞，司昌德，林 欢，曲连东*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/实验动物中心，黑龙江哈尔滨150001；2.黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆163319)

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)可以引起猪肺疫、牛羊出败、禽霍乱等疾病，是一种重要的致病菌。鸭Pm是鸭霍乱的病原，为鸭养殖业中重要的细菌性传染病之一[1]。该菌在世界各国广泛流行，在我国规模化养禽场中也时有发生。

革兰阴性细菌的外膜蛋白(Outer membrane proteins，OMPs)在致病过程中起着重要的作用，同时作为细胞膜中的一种重要成分具有良好的免疫原性，在免疫方面的作用越来越受关注。不同血清型分离株间的OMPs具有共同抗原成分，可以产生交叉保护作用。Omp H是Pm的主要外膜蛋白，可以诱导产生高水平的保护性抗体。Chevalier等认为Omp H位于菌体表面，是一种孔道形成蛋白，属于非特异性细菌外膜脂蛋白超家族[2]。Luo等研究表明纯化的天然Omp H诱导的保护率与全菌的保护率相当；Omp H和全菌都能诱导高水平的ELISA抗体[3]。

本研究设计两对引物扩增了鸭Pm C48-102株的Omp H基因，同时实现了去信号肽的Omp H基因在大肠杆菌中的表达。

1 材料和方法

1.1 菌株和质粒 鸭源Pm株C48-102购自中国兽医药品监察所；大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)、质粒pPRO-EX-htb由本实验室保存；pMD18-T购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 酶及主要试剂 EX-TaqDNA聚合酶、T4 DNA连接酶和限制性内切酶购自宝生物工程(大连)有限公司；DNA凝胶回收试剂盒购自上海华舜公司；鸭抗Pm阳性血清由本实验室制备；HRP标记的羊抗鸭IgG购自KPL公司。

1.3 Omp H基因的扩增和克隆

1.3.1 引物设计 参考已发表的Pm 70株的Omp H序列设计两对引物：PHF1：5'-CAAGGTAGTGATA CTATG-3'； PHR1： 5'-GCCAGTGTTTAACACTGGC-3'； PHF2： 5'-GCGGGATCCGCAACAGTTTACAAT CAAGAC-3'(下划线为BamHⅠ位点)；PHR2：5'-G GGCTCGAGTTAGAAGTGTACGCGTAAAC-3'(下划线为XhoⅠ位点)引物由上海invitrogen公司合成，PHF2和PHR2用于扩增去信号Omp H基因片段。

1.3.2 PCR扩增 PCR模板为煮沸菌体上清；PCR反应体系(50 μL)；反应条件：94℃4 min，然后进入32个循环：94℃ 30 s，52℃ 30 s，72℃ 1 min 30 s，最后72℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.3.3 目的基因的克隆与鉴定 PHF1和PHR1的PCR扩增产物与pMD18-T连接，按常规方法转化DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆由上海invitrogen公司测序，并与GenBank中登录的C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70和serogroup D Omp H进行序列比对。

1.4 原核表达载体的构建及鉴定 用BamHⅠ和XhoⅠ酶切回收PHF2和PHR2扩增的去信号肽OmpH，同时用BamHⅠ和XhoⅠ酶切pPRO-EX-htb质粒。将双酶切的载体与Omp H基因片段连接,将连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化子提取质粒，用BamHⅠ和XhoⅠ酶切鉴定正确的重组质粒pHTOmp H送上海invitrogen公司测序。

1.5 Omp H基因在BL221中的诱导表达及SDSPAGE分析 取测序正确的pHT-Omp H转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单个菌落，37℃振荡培养至OD600nm值0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，诱导表达5 h，同时设空白载体对照。用12%SDS-PAGE进行电泳检测。

1.6 Western blot分析 按常规方法转膜，转移后的NC膜在5%脱脂乳中封闭过夜，以1∶50用5%脱脂乳稀释的鸭抗Pm阳性血清为一抗，37℃孵育1 h，以1∶2 500倍稀释的HRP标记的羊抗鸭IgG为二抗，37℃孵育1 h，采用二氨基联苯氨为底物显色，观察结果。

2 结果与讨论

2.1 Omp H基因的扩增与克隆 利用PHF1和PHR1扩增鸭Pm C48-102株Omp H基因，与pMD18-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，阳性重组质粒测序结果显示：Omp H片段为1 180 bp，包含完整的ORF(1 056 bp)，编码351个氨基酸，其中N'端20位氨基酸为信号肽序列。同时，利用PHF2和PHR2扩增去掉N'端20位氨基酸信号肽的Omp H基因。

2.2 Omp H的序列分析 C48-102株Omp H基因与 GenBank中登录的 C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D序列比对结果表明：在核苷酸水平上同源性为82.8%～99.2%；在氨基酸水平上同源性为82.1%～99.1%。对推导的C48-102株Omp H蛋白的分析，发现在220-238位氨基酸区域存在缺失。对 Pm 48-102、C44-1、P-1059、P52、X-73、PM-70、serogroup D的OmpH蛋白分析表明：不同分离株在80位～110位和220位～238位氨基酸存在部分缺失，这与报道的Pm Omp H基因和编码的蛋白长度不同相一致[5-8]，这也可能导致不同Pm分离菌株的Omp H同源性低。

2.3 原核表达重组质粒的构建 利用pHF2和pHR2扩增的去掉N'端20位氨基酸信号肽的Omp H基因，构建的重组质粒pHT-Omp H，用BamHⅠ和XhoⅠ双酶切得到1 056 bp目的条带(图1)。对pHT-Omp进行测序，与原测序结果一致。

2.4 Omp H基因的原核表达及western blot检测将pHT-Omp H转化BL21，用IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳，在约41 ku处有一条明显的表达带，与预期的分子量大小相符(图2A)。Western blot结果表明，表达的蛋白具有免疫学活性(图2B)。Luo等研究表明：纯化的菌体Omp H诱导的保护率与全菌的保护率一致，同时Omp H和全菌均能诱导高水平的ELISA抗体，但利用重组表达的蛋白质Omp H所诱导的保护率较低，这可能与重组表达的蛋白是一种变性的蛋白，其高级结构与天然蛋白不同有关[3,8]。

本研究实现了鸭Pm C48-102株去信号肽的Omp H基因在原核系统中的表达，SDS-PAGE及western-blot表明：表达的Omp H蛋白大小与预期相符，并具有免疫学活性，为下一步研制检测鸭Pm血清学检测方法奠定了基础。

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