内源和外源性禽白血病病毒鉴别PCR检测方法的建立

周 刚，牛成明，司昌德，韩凌霞

(中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江哈尔滨150001)

禽白血病(Avian leukosis，AL)是由反转录病毒科甲型反转录病毒属AL病毒(ALV)引起的禽类造血组织中某些细胞成分过度增生的肿瘤性疾病[1]；ALV的感染还可引起鸡群的免疫抑制[2]和生产力的严重下降。根据致病性和感染宿主的不同，ALV被划分为A-J 10个亚群[3]，其中A-D亚群为外源性ALV，主要感染蛋鸡，A、B亚群主要诱发鸡的淋巴细胞白血病，而C、D亚群在野外极为少见；E～I亚群为内源性ALV，其中E亚群为整合在鸡染色体中一种前病毒DNA，在鸡群中普遍存在[4]，而F～I亚群的宿主为野生禽类，包括雉、鹧鸪、鹌鹑和鹰等[5]。J亚群具有独特的亚群特异性，主要引起肉鸡的髓细胞瘤[6]。外源性ALV能诱发肿瘤，可垂直和水平传播，而内源性ALV的致瘤性很低，不能产生感染性病毒粒子[7]，但内外源性ALV的重组将导致高致病性毒株的产生[8]。

近年来报道了多种ALV的检测方法，但均无法区分内源性和外源性ALV[9]。本研究根据ALV各亚群共有的p27基因和决定ALV亚群特异性的env基因设计引物，建立了ALV的通用检测并鉴别内、外源性ALV的多重PCR检测方法，以期为ALV的临床诊断提供有效的手段。

1 材料和方法

1.1 病毒株和主要试剂 A亚群ALV标准毒株(RAV-1)购自中国兽医药品监督所，网状内皮组织增生症病病毒(REV)、鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)和DF-1细胞由本实验室保存；SPF鸡胚由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所提供；M-MLV反转录酶、rTaqDNA聚合酶、pMD18-T载体等均购自大连宝泰克生物有限公司；胶回收试剂盒、病毒RNA提取试剂盒等均购自上海华舜生物技术有限公司；胎牛血清购自PAA公司。

1.2 重组质粒的构建 ALV p27群通用型特异性引物序列按照文献[8]合成，上下游引物分别为pF：5'-CCATGCCTGTAGTGATTA-3'和 pR：5'-CCCGAC CCAGTTTGTCCAT-3'，预期扩增大小为 793 bp。外、内源性ALV的特异性引物的设计根据A亚群标准株RAV-1(DQ365814)和E亚群标准株ev1(AY01313)的env基因保守序列，外源性ALV的上下游引物分别为AF：5'-GACTTTACTGGCGGTCCT GA-3' 和 AR： 5'-CCCCACCTGTGAGCAGTTAT-3'，预期扩增大小为387 bp；内源性ALV的上下游引物分别为 EF：5'-ACACCTGTGGAGATGTGCAG-3'和ER：5'-GATCCACGCCCCTGATG-3'，预期扩增大小为234 bp。RAV-1种毒通过DF-1细胞增殖，按照RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，反转录成cDNA(RAV-cDNA)后，利用p27基因和外源性ALV的特异性引物进行PCR扩增，酚/氯仿法提取疑似感染内源性ALV的鸡胚基因组DNA(ALVE-DNA)，并利用内源性ALV特异性引物进行PCR扩增。胶回收p27基因、外源性和内源性ALVenv基因的PCR扩增片段，克隆于pMD18-T中构建重组质粒并测序验证，重组质粒分别命名为pp27、pA和pE。

1.3 多重PCR反应条件的优化 在25 μL反应体系下，以等浓度混合的(100 ng/μL)RAV-cDNA和ALVE-DNA为模板，固定引物AF、AR的浓度，将引物 EF、ER和 PF、PR的浓度在 5 pmol/μL～20 pmol/μL，退火温度在48℃～60℃之间进行调整，以确定多重PCR反应的最佳引物浓度和退火温度；在此基础上将多重PCR的延伸时间在20 s～120 s之间进行优化，以确定最佳延伸时间。

1.4 多重PCR反应的特异性试验 参考病毒RNA提取试剂盒说明书提取REV和IBDV的RNA，反转录成cDNA并利用建立的多重PCR方法分别对RAV-cDNA和ALVE-DNA混合物、RAV-cDNA、ALVE-DNA、REV cDNA、IBDV cDNA进行扩增，以检测该方法的特异性。

1.5 多重PCR反应的敏感性试验 用分光光度计测定RAV-cDNA和ALVE-DNA的浓度，并对各稀释度(109copies/μL ～101copies/μL)的混合 DNA 进行多重PCR扩增，以检测该方法的敏感性。

1.6 多重PCR反应的初步应用和符合性试验 采集现地一只疑似感染ALV的病死鸡的肝脏、脾脏、肾脏、肺脏和心脏，以及10枚不同来源地的疑似感染内源性ALV的鸡胚，按常规方法提取基因组DNA，利用建立的多重PCR方法和IDEXX公司的ALV p27抗原ELISA检测试剂盒检测内、外源性ALV的感染情况。

2 结 果

2.1 pp27、pA和pE重组质粒的测序结果 1株pp27与亲本株RAV-1、B亚群 RAV-2株(KO2374)、ALV-E ev1株的核苷酸序列同源性分别为100%、99.76%和98.24%；1株pA与RAV-1株、RAV-2株的核苷酸序列同源性分别为97.6%和98.6%，与ev1株的同源性仅为74%；1株pE与ALV-E ev3株(AY013304)、ev1株核苷酸序列同源性分别为99.76%和99.28%，与RAV-1、RAV-2株的同源性均为54%。

2.2 多重PCR最佳反应条件的确定 经过对各反应条件的优化，最终确定在25 μL PCR反应体系中，浓度均为20 pmol/μL的p27、ALVA、ALVE引物各 0.6 μL、0.25 μL 和 0.125 μL；最佳退火温度为50℃；最佳延伸时间为40 s。

2.3 多重PCR反应的特异性试验 RAV-cDNA和ALVE-DNA混合物扩增出793 bp、387 bp和234 bp的特异性片段，RAV-cDNA仅扩增出793 bp和387 bp的特异性片段，ALVE-DNA仅扩增出793 bp和234 bp的特异性片段，而从REV和IBDV cDNA中均未扩增出任何片段。表明建立的多重PCR方法具有良好的特异性(图1)。

2.4 多重PCR反应的敏感性试验 当RAV-cDNA和ALVE-DNA的浓度均为103copies/μL时仍可得到清晰特异的片段，表明建立的多重PCR方法的灵敏度为 2×103copies(图 2)。

2.5 现地样品的检测 肝、脾、肾和肺均扩增出793 bp、387 bp和234 bp的特异性片段(图3)，而9枚鸡胚仅扩增出793 bp和234 bp的特异性片段(图4)，而且肝、脾、肾、肺和9枚鸡胚的ELISA检测结果均为阳性(S/P大于0.4)，与多重PCR的检测结果完全符合，表明现地患病鸡感染了外源性和内源性ALV，而鸡胚仅感染了内源性ALV。

3 讨 论

本研究选择p27群特异性抗原的基因序列设计一对引物，通过优化反应条件建立了检测ALV并鉴别外源性和内源性ALV的多重PCR检测方法，该方法可鉴定所有亚群的ALV，以此区分从临床上难以鉴别的禽病，如禽网状内皮组织增生症。由于ALV囊膜糖蛋白的编码基因(env)容易发生变异，其在ALV外源性A、B、C、D亚群和内源性E、J亚群中的同源性仅为40%[10]，因此，该方法将ALV A亚群标准毒株RAV-1和内源性ALV ev1(ev基因座)的env基因作为靶基因设计2对特异性引物，可对外源性和内源性ALV的感染进行区分。本研究所建立的多重PCR方法具有特异、敏感、经济高效等优点，将为外源性ALV的临床检测、鸡群的防制净化及ALV的试验研究提供重要的手段。

[1]赵振华，杨玉莹，成子强，等.禽白血病[M].北京：中国农业出版社，2006：11-12.

[2]马秀丽.鸡病毒性免疫抑制病的发展趋势与防制措施[J].山东畜牧兽医学报，2000，30(2)：37-39.

[3]靳艳玲，罗薇.禽白血病研究进展[J].西南民族大学学报，2005，24(4)：44-46.

[4]杨玉莹.J亚群禽白血病病毒研究进展[J].中国病毒学，2003，18(1)：93-97.

[5]Payne L N.Developments in avian[J].Leukemia,1999,6(3):150-152.

[6]Jeffrey A,Walid H.Characterization of endogenous avian leukosis viruses in chicken embryonic fibroblast substrates used in production of measles and mumps vaccines[J].Virology,2001,75(8):3605-3612.

[7]Payne L N.The emergence of subgroup J avian leukosis virus[J].Leukemia,2003,27(6):36-45.

[8]李新华.禽白血病流行病学特点及防制措施[J].养禽与禽病防治，1997，20(4)：11-12.

[9]罗明星，周碧君，李永明.禽淋巴细胞白血病的诊断与病毒亚群鉴定[J].中国动物检疫，2009，26(3)：55-57.

[10]Chesters P M,Howes K,Petherbridge L,et al.The viral envelope is a major determinant for the induction of lymphoid and myeloid tumours by avian leukosis virus subgroups A and J,respectively[J].Gen Virol,2002，83(10),2553-2561.