重庆地区山羊嗜血支原体(附红细胞体)感染率调查及危险性因素评估

周作勇，聂奎，胡世君，罗洪林，汤明，胡友兰，唐成，於剑，席进

(1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆402460；2.西南大学动物科技学院，重庆400715；3.重庆市动物卫生监督总站，重庆401147；4.重庆市中药研究院，重庆400065)

重庆地区山羊嗜血支原体(附红细胞体)感染率调查及危险性因素评估

周作勇1，聂奎2*，胡世君1，罗洪林2，汤明3，胡友兰3，唐成2，於剑4，席进1

(1.西南大学荣昌校区动物医学系，重庆402460；2.西南大学动物科技学院，重庆400715；3.重庆市动物卫生监督总站，重庆401147；4.重庆市中药研究院，重庆400065)

为调查山羊嗜血支原体(附红细胞体)在重庆地区的感染率并评估危害其感染的因素，本研究将采集于重庆14个区县的共1 191份山羊血液样本，分别采用染色镜检和PCR方法进行检测，并对不同养殖方式和地理条件进行分析。结果显示：山羊嗜血支原体感染率为16.1%，其中丘陵地区感染率(13.7%)低于山区(18.6%)，规模化养殖场感染率(14.3%)低于农户散养(17.1%)。危险性因素分析结果显示：山区山羊嗜血支原体感染率是丘陵地区的1.43倍(OR 1.43，95%CI 1.05-1.95；χ2=5.13，d.f.=1，p=0.02)，并且差异显著；农户散养山羊嗜血支原体感染率是规模化养殖的1.23倍(OR 1.23，95%CI 0.88-1.71；χ2=1.51，d.f.=1，p=0.22)，差异不显著。表明不同的地理条件与山羊嗜血支原体感染率密切相关。

山羊嗜血支原体(附红细胞体)；感染率；危险性因素

羊嗜血支原体(附红细胞体)病是由羊嗜血支原体(Haemotrophic Mycoplasma)寄生于红细胞表面或血浆，引起羊以溶血性贫血、黄疸、增重率低和精神沉郁为主要症状的一类疾病[1-2]。我国最早于1982年报道了羊嗜血支原体病。近年来，该病的发生和报道日渐增多，给养羊业造成一定的经济损失[3-9]。由于目前尚无系统的羊嗜血支原体感染流行病学调查资料，因此很难对该疾病所造成的危害进行评估。本研究采用PCR结合传统检测嗜血支原体的方法，对重庆地区山羊嗜血支原体进行感染率调查，并对不同地理条件和养殖方式进行分析，以此评估危害该病感染的因素。

1 材料和方法

1.1 临床样本采集及主要试剂根据重庆市地理特点[10]，选择荣昌、城口、石柱和秀山等14个区县，对山羊颈静脉采血。羊嗜血支原体阳性样本由本实验室保存；Taq DNA聚合酶、DL2000 DNA Marker均购于TaKaRa公司；全血基因组DNA提取试剂盒购于Promega公司。

1.2 显微镜检查血样采用灭菌生理盐水稀释，压片镜检。同时按照文献[11]方法进行瑞氏染色和姬姆萨染色镜检。

1.3 PCR检测

1.3.1 DNA模板的制备将抗凝血2 000 r/m in，离心2 min，按照DNA提取试剂盒说明书提取DNA。以羊嗜血支原体阳性样本做对照。

1.3.2 引物设计及合成参考GenBank登录的羊嗜血支原体16S rRNA序列(AF338268)，利用Oligo6.1软件设计特异性引物，5'-CGAACGAGTAGAACTTG TTCTGCT-3'和5'-TAGTACCATCAAGGCGCGCTCA T-3'，由上海英骏生物技术有限公司合成，扩增片段长度为420 bp。

1.3.3 PCR检测PCR反应程序：94℃5m in；94℃30 s、58.5℃30 s、72℃30 s，30个循环；72℃7m in。产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。

1.4 危险性因素分析根据PCR检测结果，以养殖方式和地理条件作为评估该病的危险性因素，计算比数比(OR)和95%的置信度(95%CI)，以SPSS 11.5软件进行卡方检验。

2 结果与讨论

2.1 PCR检测与常规方法检测结果比较采用不同方法对重庆市14个区县1 191份山羊血液样本进行检测，结果如表1所示。其中PCR方法检测感染率以石柱、忠县、武隆最高，均在20%以上；城口、丰都、铜梁、秀山等次之，感染率在16%～20%之间；而荣昌、永川、大足和江津等区县的感染率较低，表明重庆市渝东地区的羊嗜血支原体感染率高于渝西地区。4种检测方法的结果显示，鲜血压片法、瑞氏染色法、姬姆萨染色法和PCR方法平均检出率分别为61.0%、66.8%、70.4%和16.1%。传统涂片染色镜检的检测阳性率显著高于PCR方法，主要原因可能有两个方面，其一，由于红细胞的变形、涂片染色时的染色颗粒沉积、显微镜质量差异等原因可能导致检测结果出现假阳性[5,11]；其二，山羊嗜血支原体病一般以隐性感染为主，如果山羊感染了其他血液寄生病原如无形体等，目前仅靠普通光学显微镜无法分辨出差异，从而造成假阳性[1,13-14]。因此，传统镜检方法判断羊嗜血支原体感染结果不准确，而本研究采用PCR方法的检测结果进行羊嗜血支原体感染危险性的分析。

2.2 羊嗜血支原体感染的危险性因素根据PCR检测结果进行感染危险性因素分析，结果如表2所示。由不同的地理条件，山区羊嗜血支原体感染率显著高于丘陵地区，分别为18.6%和13.7%，山区的感染率是丘陵地区的1.43倍，并且差异显著(OR=1.43，95%CI为1.05-1.95，χ2=5.13，d.f.=1，p=0.02)，表明山区和丘陵不同的地理条件是山羊感染嗜血支原体的危险性因素。由不同养殖方式分析，农户散养山羊嗜血支原体感染率是规模化养殖的1.23倍，分别为17.1%和14.3%，但差异不显著(OR=1.23，95%CI为0.88-1.71，χ2=1.51，d.f. =1，p=0.22)。有研究表明羊嗜血支原体主要通过活的媒介物如蜱、螨等吸血节肢动物传播[3,12]，在山区的地理条件下，山羊接触蜱、螨等吸血昆虫的机率远高于丘陵地区，因而更容易传播羊嗜血支原体，这也成为该病原感染的危险性因素。虽然农户散养山羊也容易接触传播媒介，本次调查的结果也显示散养山羊嗜血支原体的感染率高于规模化养殖，但无显著性差异，因此，养殖方式并非山羊感染嗜血支原体的直接危险性因素。究其原因可能是采集的血液样本分别为山区地理条件下山羊规模化养殖以及丘陵地区农户散养模式下的血液样本导致的。

表1 PCR方法与常规检测方法对羊嗜血支原体感染检测结果的比较Table 1 Comparison of Haemotrophic Mycoplasma infection rate detected w ith PCR and other routinemethods

表2 重庆地区山羊感染嗜血支原体危险性因素分析Table 2 Risk factors analysis for Haemotrophic Mycoplasma infection of goats in Chongqing

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(本文编辑：张朝霞)

Infection rate and risk factors analysis of Haemotrophic Mycoplasm a(form erly Eperythrozoon ovis)in Chongqing area

ZHOU Zuo-yong1,NIE Kui2*,HU Shi-jun1,LUO Hong-lin2,TANG M ing3,HU You-lan3, TANG Cheng2,YU Jian4,XIJin1
(1.Rongchang Campus,Southwest University,Chongqing 402460,China;2.College of Animal Science and Technology, Southwest University,Chongqing 400715,China;3.Chongqing Animal Health Supervision Station,Chongqing 401147,China; 4.Chongqing Academy of Chinese Materia Media,Chongqing 400065,China)

In this study,we collected 1 191 goat blood samples from 14 counties in Chongqing area,of which detected Haemotrophic Mycoplasma(formerly Eperythrozoon ovis)by staining m icroscopy and 16S rRNA-PCR,and the geographic condition and breed mode were evaluated as risk factors associated w ith the infection.The results showed that 16.1%of samples were detected Haemotrophic Mycoplasma positive infection,of which 13.7%were in hilly areas and 18.6%in mountain areas. The infection rate of Haemotrophic Mycoplasma in scale farm(14.3%)was lower than that of unscaled farm(17.1%).Infection rate of Haemotrophic Mycoplasma of goats breed inmountain areaswas 1.43 times higher than that in hilly areas(OR=1.43,95% CI=1.05-1.95;χ2=5.13,d.f.=1,p=0.02),Infection rate in goats w ith Scatter-Feed mode was 1.23 times higher than that of intensive culture(OR=1.23,95%CI=0.88-1.71;χ2=1.51,d.f.=1,p=0.22).The results demonstrated that different geographic condition was highly associated w ith Haemotrophic Mycoplasma infection of goats.

Haemotrophic Mycoplasma(formerly Eperythrozoon ovis);infection rate;risk factors

S852.64

A

1008-0589(2010)07-0563-04

*Corresponding author

2009-08-11

重庆市自然科学基金重点资助项目(2006BA1009)

周作勇(1979-)，男，四川冕宁人，博士研究生，讲师，主要从事动物传染病和寄生虫病研究.

*通信作者：E-mail：niekui@126.com