鸡IFN-γDNA壳聚糖纳米粒的制备及外源基因表达

殷 吉吉，张文龙，刘霓红，杨 涛，步志高，王君伟，吴东来*

(1.中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/农业部兽医公共卫生重点开放实验室，黑龙江哈尔滨150001；2.东北农业大学动物医学学院，黑龙江哈尔滨150030)

干扰素(Interferon，IFN)分为两类：Ⅰ类IFN主要包括IFN-α、IFN-β；Ⅱ类IFN又称为IFN-γ[1]。IFN-γ具有提高MHC分子表达、增强NK细胞杀伤作用、促进巨噬细胞的吞噬能力和炎症反应等免疫调节功能。IFN-γ作为一种天然的免疫应答介导物，具有良好免疫佐剂作用。

壳聚糖(Chitosan，CS)是由甲壳素经脱乙酰化作用处理后的产物，其化学名为聚-2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖。作为一种天然的聚阳离子多糖化合物，CS广泛分布于藻类、真菌、节肢动物及贝类等软体动物的贝壳中。由于CS具有天然无毒性、良好的生物相容性、可降解、可再生性且原材料丰富、成本低等特点，有望成为广泛使用的药物载体。已有研究表明CS具有较强的核酸结合能力，可提高核酸对核酸裂解酶的稳定性[2-3]，同时由于CS具有的天然免疫活性，还能协同增强核酸免疫作用[4]。

本实验利用CS包裹含有禽源高效启动子β-acting启动子的鸡IFN-γ表达重组质粒pCAGGS-ChIFN-γ制备了CS纳米颗粒(CNPs)，并对粒径大小、Zeta电势、DNA保护性能及体外转染能力等方面进行了研究。

1 材料和方法

1.1 菌种、质粒与实验动物 鸡IFN-γ真核表达重组质粒pCAGGS-ChIFN-γ[5]、大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α感受态菌种由本实验室保存；9日龄～10日龄SPF鸡胚由本所提供。

1.2 主要试剂及仪器 CS：分子量147 ku，脱乙酰度96.2%购自山东奥康生物制品有限公司；抗鸡IFN-γ多克隆血清为哈尔滨兽医研究所刘胜旺博士提供；DNA Marker、DNaseⅠ购自宝生物工程(大连)有限公司；质粒中提试剂盒购自美国Promega公司；分析纯级茚三酮购自上海化学试剂公司；LipofectamineTM2000转染试剂盒购自美国Invitrogen公司；Opti-MEM、DMEM和胎牛血清购自美国GIBCO公司；壳聚糖酶、FITC标记绵羊抗兔IgG和Hoechst 33258购自美国Sigma公司。Microplate Fluorescence Reader(FLx800)为Bio-Tek公司产品；JEM-1200透射电子显微镜为日本电子公司产品；3000HS型光子相关色谱仪为英国Malvern Instruments公司产品。

1.3 CNPs制备 将CS溶解在5 mmol/L NaAC缓冲液(pH5.5)中制成浓度为 200 μg/mL的 CS溶液，与含有 5 mmol/L Na2SO4的 DNA 溶液(100 μg/mL)分别预先加热到50℃～55℃，等体积迅速混合，涡旋30 s，室温放置1 h，即制备成CNPs胶体溶液[6]。

1.4 CNPs的药剂学评价

1.4.1 CNPs纳米粒的形态、粒径和Zeta电势的测定 取少量CNPs胶体溶液滴加于铜网上，2%磷钨酸负染，透射电子显微镜下观察纳米粒的形态。另取纳米粒胶体溶液适量，用PCS测定纳米粒平均粒径、粒径分布及Zeta电位。

1.4.2 CNPs的包封率和载药量测定 包封率测定：取CNPs胶体溶液于高速冷冻离心机上(4℃，50 000 g，30 min)离心分离，按照每100 mL荧光剂缓冲液(2 mol/L NaCl，0.05 mol/L Na3PO4，pH7.4)加入 50 μL Hoechst 33258浓缩液(0.2 g/mL溶于水)，配置Hoechst 33258稀释液。在白色96孔板中的4个孔中分别加入 0 μL，0.1 μL，1 μL，10 μL 适量稀释的待测样品，以Hoechst 33258稀释至300 μL。充分混匀，用Microplate Fluorescence Reader测定样品的相对荧光强度(F)。根据标准曲线c(ng/mL)=0.0752 F-1.5234计算溶液中游离的DNA含量，并按下式计算包封率：包封率(%)=(W总-W游)/W总×100%(W总：DNA的加入量；W游：上清液中DNA的测得量)。

载药量测定：取CNPs胶体溶液于高速冷冻离心机上按上述条件离心分离，取上清液1.0mL置10mL量瓶中，加入2 mol/L pH5.5醋酸钠缓冲液和1%茚三酮试剂各1 mL，重蒸水补至3 mL，混合均匀，于沸水浴加热10 min，取出迅速冷却至室温，加60%乙醇稀释至刻度，摇匀，静置20 min，于570 nm处测定吸收度(A)；根据标准曲线c(μg/mL)=158.88 A-0.0749，计算溶液中游离CS的含量；按下式计算载药量：载药量(%)=WDNA/(WCS+WDNA)×100%。(WDNA：纳米颗粒中DNA量；WCS：纳米颗粒中CS量)。

1.4.3 凝胶阻滞分析 CNPs因荷正电而停止向正极的移动，滞留于加样孔中。用凝胶阻滞分析法验证DNA/CS多聚复合物的形成及电荷性质。

1.4.4 DNA保护能力测定 将1 μg DNA和含10 μL CNPs 悬液(含 有 DNA 1 μg)分别 与 10 μL 40 u/mL的DNaseⅠ在37℃下作用15 min。在处理过的纳米颗粒中加入16 μL 0.2 u/mL的CS酶溶液和4 μL 100 u/mL的溶菌酶溶液，37℃反应4 h。同时设置DNaseⅠ阴性对照组与CS酶阴性对照组，以及先加入CS酶后加入DNaseⅠ对照组。反应结束后经0.8%琼脂糖凝胶电泳观察DNA降解情况。

1.4.5 体外转染实验 参照脂质体LipolectamineTM2000使用说明进行转染，同时取DNA相同含量的CNPs悬液转染CEF细胞。72 h后弃去培养液，用PBST洗涤1次后自然干燥，用预冷700 mL/L乙醇4℃固定30 min，自然干燥。用PBST洗涤，取兔抗鸡IFN-γ多克隆抗血清1∶20稀释，每孔加入适量血清稀释液，置湿盒内37℃作用45 min。用PBST洗涤，自然干燥。将FITC标记绵羊抗兔IgG按1∶160稀释，每孔加入适量抗体稀释液，置黑暗湿盒内37℃作用45 min。用PBST洗涤，去离子水洗涤脱盐后，分别利用荧光显微镜和Microplate Fluorescence Reader检测荧光和相对荧光强度。

1.4.6 CNPs的稳定性实验 分别取4℃和室温保存 5 个月的 10 μL CNPs子悬液(含有 DNA 1 μg)与10 μL 40 u/mL的 DNaseⅠ在 37℃下作用 30 min，加入碘乙酸溶液(终浓度为5 mM)终止反应。同时设裸DNA对照组。

2 结 果

2.1 CNPs的形态、直径和Zeta电势的测定 制备的CNPs在电镜下呈不规则球形，结构紧密，大小较均一(图1)。激光粒度分析仪测定结果表明，CNPs的平均粒径为172.6 nm±5.1 nm，Zeta电势20.8 mV±2.9 mV。

2.2 CNPs的包封率和载药量的测定 测定结果表明制备的CNPs的包封率为91.21%±2.54%，载药量为31.93%±0.16%。

2.3 凝胶阻滞分析与DNA保护性、释放实验 电泳结果显示(图2)，制备的CNPs滞留在上样孔中，而DNA由负极向正极移动。CNPs在与CS酶作用后可以将包裹的DNA释放。在DNaseⅠ的条件下裸露的DNA已经被大部分降解，而CNPs由于有CS的保护未被DNaseⅠ降解，在与CS酶作用后依然可以释放DNA。并且释放后的DNA经DNaseⅠ作用同样可以被降解。

2.4 体外转染实验 分别在荧光显微镜下观察和在Microplate Fluorescence Reader中检测荧光和相对荧光强度。结果显示(图3)，CNPs可以在体外正确表达(图3C)，但表达效率较低。CEF细胞对照组、CNPs子转染CEF细胞组、DNA LipolectamineTM2000Reagent转染 CEF组的 Microplate Fluorescence Readerp检测结果分别为：26、134、820。CNPs体外转染效率约为LipolectamineTM2000转染效率的16.3%。

2.5 CNPs的稳定性实验 室温与4℃保存5个月的CNPs均产生了不同程度的絮凝，去上清悬液，经琼脂糖凝胶电泳结果显示：在与40 u/mL的DNaseⅠ反应30 min，裸露的DNA几乎被完全降解，而室温与4℃保存5个月的CNPs均可以保持良好的DNA保护能力（图4）。

3 讨 论

CS具有良好的生物相容性和生物降解性，制备的CNPs具有缓慢释放、靶向作用等特点，已被广泛地用作药物、酶等的载体[7]。1995年，Alexaki等首次报道CS溶液与DNA以自聚集的方式沉淀能得到一种大小为150 nm～500 nm的复合物，于是初步认为CS具有用于基因治疗载体的潜在价值[8]。随后的实验证实：以CS作为载体物质的疫苗经口免疫能诱导产生对弓形虫的有效免疫反应[9]。李惠等通过体内实验证实，包裹后的质粒DNA可以显著提高目的基因-IL-2基因在体内的表达，明显增强体液和细胞免疫水平，增强对大肠杆菌的抗病能力[10]。

本研究将pCAGGS-ChIFN-γ[6]与CS进行包装，形成CNPs。由于CS的包裹，使得包装后的CNPs对DNA的保护能力明显增强。实验过程中所使用的DNaesⅠ的浓度(40 u/mL)远远高于生理环境下核酸酶的浓度，所以在正常生理条件下CNPs会对DNA起到非常好的保护作用。在保存5个月后CNPs已经产生不同程度的絮凝，但上清中的CNPs依然具有良好的DNA保护作用。实验中CNPs产生了絮凝，将会严重影响其产量与质量，所以如何保存CNPs是今后需要解决的问题。

本研究采用的CS分子中96%以上的部分是由2-氨基葡萄糖苷重复单位组成，氨基基团重复单位的pKa为6.5左右，在pH5.5的条件下，CS带大量正电荷。DNA的磷酸基团带有多聚负电荷，因此CNPs通过两者之间的电荷凝聚作用形成。实验中将溶液加热到50℃～55℃，可以降低溶液黏度，防止形成的CNPs发生聚集，而这个温度不会对DNA造成损伤。通过DNA的释放实验证实，包装成CNPs在与CS酶作用后依旧可以释放出完整的DNA。同时在体外转染实验中证明细胞内CNPs释放后的DNA可以正确表达。

CS作为一种基因药物载体存在许多优点，但同样也存在很多不足。笔者在实验中发现CNPs的转染效率较低(约为脂质体的16.3%)，而且CS只溶于微酸溶液，这将影响CS在实践中的应用。改造CS使之成为一种高效的基因药物载体已成为目前亟待研究的课题。

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