牛病毒性腹泻病毒E2蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

聂明非，李 岩，温 凯，贾 莹，王君伟

(东北农业大学动物医学院，黑龙江哈尔滨150030)

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是由BVD病毒(BVDV)引起的一种以腹泻、黏膜病、持续感染、免疫抑制以及母畜流产为主要症状的接触性传染病[1]。该病呈全球性分布，给养牛业造成了很大的经济损失。BVDV与猪瘟病毒(CSFV)、羊边界病病毒(BDV)同属黄病毒科瘟病毒属成员，其基因组为单股正链RNA，全长约12.3 nt～12.5 nt[2]，整个基因组含有一个大的开放阅读框架(ORF)和两侧的非翻译区(UTR)[2]。

E2(gP53)位于BVDV ORF 2077位～3198位核苷酸，由374个氨基酸残基组成，有5个可能的N-端糖基化位点,这些位点在BVDV不同毒株中非常保守，去糖基化分子量约为42 ku[3]。E2与Erns和E1是病毒的结构蛋白，形成表面突起伸向囊膜表面[4]。在BVDV所有结构蛋白之中，E2蛋白是免疫原性最强的糖蛋白，靠近N末端的一半含有多种依赖于构象的抗原结构域，其N端伸出BVDV囊膜表面，是决定BVDV抗原性的主要部位，也是与抗BVDV抗体结合、介导免疫中和反应及与宿主细胞识别、吸附的主要部位[5-7]。

本实验利用BVDV基因免疫BALB/c小鼠，用病毒作为筛选抗原制备单抗，旨在筛选出针对BVDV的特异性单克隆抗体(MAb)，为BVD诊断方法的建立提供一定的物质材料。

1 材料和方法

1.1 病毒株、质粒、细胞及实验动物 BVDV VEDEVAC株和CSFV C株、pcDNA-E2质粒、骨髓瘤细胞SP2/0、MDBK细胞由本实验室保存；PK-15细胞由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所仇华吉研究员惠赠；4～6周龄清洁级BALB/c雌鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2 主要试剂 FITC标记羊抗鼠IgG、HRP标记羊抗鼠IgG购自北京中衫金桥公司；FITC标记兔抗猪IgG、FITC标记兔抗牛二抗购自北京博奥森生物技术有限公司；HAT、HT选择培养基、PEG3350、碘化丙啶(PI)、秋水仙素、4-氯-1-萘酚均购自Sigma公司；1640、DMEM培养基购自Gibco公司；胎牛血清购自天津灏洋生物有限公司；MAb亚类鉴定试剂盒购自Invitrogen公司；

1.3 MAb的制备

1.3.1 动物免疫 采用肌肉注射的方式，每只小鼠100 μg pcDNA-E2质粒，首免后每3周进行1次免疫，第3次免疫后1周进行加强免疫，1周后检测抗体效价，达到要求后进行细胞融合。

1.3.2 MAb检测方法的建立 对BVDV采用超速离心的方法进行纯化，作为检测抗原；小鼠三免后采血并分离血清为一抗，初步建立间接ELISA方法作为MAb的筛选方法。判定标准为阳性血清的OD450nm接近1.0，P/N最大。

1.3.3 细胞融合和克隆 参照文献[8]进行细胞融合。采用间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞，将得到的阳性细胞株用有限稀释法进行细胞克隆纯化，直到克隆细胞达到100%阳性后，扩大培养，并冻存。

1.4 MAb亚类的鉴定

1.4.1 MAb亚类鉴定 采用MAb亚类鉴定试剂盒进行鉴定。

1.4.2 MAb染色体鉴定 参照文献[9]介绍的秋水仙素法对杂交瘤细胞进行染色体鉴定。

1.4.3 杂交瘤细胞的稳定性检测 将3株杂交瘤细胞冻存后复苏，连续传20代收集上清，用间接ELISA检测培养上清中的抗体效价。

1.4.4 MAb western blot鉴定 用截短表达的6段重组E2蛋白进SDS-PAGE；转印至硝酸纤维膜上，5%脱脂乳4℃过夜封闭；与MAb上清37℃作用2 h，PBST洗膜4次；再与HRP标记的羊抗鼠IgG 37℃作用1.5 h，PBST洗膜4次；4-氯-1-萘酚显色，去离子水终止。

1.4.5 MAb与BVDV和CSFV的反应性 将生长良好的MDBK/PK-15细胞接种至96孔板，培养约18 h后接种BVDV/CSFV，继续培养约48 h/70 h后4%多聚甲醛固定；PBS洗板后用三株MAb上清37℃孵育2 h，同时作阴阳性血清对照；PBS洗板后用FITC标记的羊抗鼠二抗/兔抗牛二抗/兔抗猪二抗(均1:200稀释)，37℃孵育1.5 h，PBS洗板后用PI染色，在荧光显微镜下观察。

2 结果与讨论

2.1 MAb检测方法的建立 纯化后的病毒采用1∶200稀释，包被液为pH9.6的碳酸盐缓冲液，4℃过夜；5%脱脂乳37℃封闭2 h；阴阳性血清1∶800稀释；羊抗鼠二抗1∶5 000稀释 37℃孵育 1 h；TMB显色8 min。

2.2 MAb亚类鉴定 经MAb亚类试剂盒鉴定，结果2E2和4D6为IgM类，3D12为IgG2a亚类，轻链均为κ链。

2.3 杂交瘤细胞染色体的鉴定 3株杂交瘤细胞经计算各10个分裂相的平均值，染色体数目为85条～95条，该数值大于脾细胞染色体数目的2倍，小于并接近脾细胞与骨髓瘤细胞的染色体数目之和，表明该株杂交瘤细胞确为脾细胞与骨髓瘤细胞融合而成。

2.4 杂交瘤细胞分泌MAb上清的稳定性 将收集的20代上清进行间接ELISA检测，读取OD450nm，3株MAb的OD450nm没有发生明显变化，表明3株杂交瘤细胞均能稳定分泌MAb。

2.5 MAb western blot鉴定 3株MAb均不能与截短表达的重组E2蛋白作用。这与本实验的免疫原和筛选抗原有关。基因免疫是将含有编码抗原基因的重组真核表达质粒直接免疫机体，使载体上的基因在体内经过转录、翻译和修饰，持续表达出接近天然的抗原物质，E2的真核表达质粒进入小鼠体内后表达出与天然的E2相似的结构，用纯化的病毒作为筛选抗原即可以筛选出针对E2构象表位和线性表位的抗体，并且本实验细胞融合的次数较少，因此所制备的MAb针对构象表位是可能的。

2.6 MAb与BVDV和CSFV的反应性 BVDV与MAb上清的间接免疫荧光结果发现：MAb 2E2、3D12和4D6均能识别结合BVDV，镜下可见绿色荧光，阴性血清未现绿色荧光(图1，2，3，4)；CSFV与MAb上清的间接免疫荧光结果显示：MAb 3D12与CSFV反应出现荧光，MAb 2E2和4D6未发现荧光，表明MAb 2E2和4D6为针对BVDV的特异性MAb(图5，6，7，8)。用 pcDNA-E2免疫小鼠，刺激机体产生了天然的E2蛋白，该蛋白上具有不同CSFV的抗原表位，以western blot和免疫荧光等检测手段相结合，达到筛选特异性MAb的目的。张丽颖等[10]用重组蛋白免疫小鼠制备MAb，未筛选出针对BVDV的特异性MAb。因为重组蛋白和天然抗原性质不同，以此方法筛选出的MAb是针对线性表位的，而E2是糖蛋白，线性表位理论上不多[11]。

BVDV与CSFV同为瘟病毒属成员，其基因序列和氨基酸序列有较高的同源性，并且有相似的感染谱[12]，常规的血清学方法不易区分BVDV和CSFV，给鉴别诊断带来了一定的困难。E2是BVDV和CSFV的主要结构蛋白，是变异率最高的一种蛋白，根据间接免疫荧光结果表明BVDV和CSFV在构象上存在差异。因此，本实验用E2的真核表达质粒作为免疫原，用病毒作为筛选抗原制备出针对BVDV的特异性的与CSFV不发生交叉反应的MAb，作为鉴别诊断的工具。但MAb亚类不利于应用，能否作为鉴别诊断的工具有待进一步研究。

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